超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定辣條中的5種罌粟堿

花露,葉平,陸杰,黃銀波,馬紅,王愛霞

(泰州市產品質量監督檢驗院，江蘇 泰州 225300)

調味面制品俗稱“辣條”，近年來受到大家的熱烈追捧，網絡上甚至出現 “吃根辣條壓壓驚”的流行語。青少年兒童特別是中小學生是主要消費群體[1]。近期有關火鍋底料、調味料中檢出罌粟堿的新聞報道層出不窮。周圍不少家長反映孩子特別喜歡吃辣條，吃了還要吃，不免讓人擔心不法商家為了達到讓顧客上癮的目的，向其中添加違禁品罌粟殼。罌粟殼為植物罌粟干燥成熟的果殼，主要成分為罌粟堿、那可丁、嗎啡、蒂巴因、可待因，具有斂肺、澀腸、止痛的功效[2]。但若經常大量食用含罌粟堿的食品可能會造成人體消化系統、精神系統的損傷，危害消費者的身體健康。國家藥品監督管理局、衛生部以及公安部的相關法規都明令禁止在食品中非法添加罌粟殼。

目前測定罌粟堿的方法尚無國家標準，已經報道的檢測方法主要有薄層色譜分析法[3,4]、酶聯免疫法(ELISA)[5,6]、示波極譜法[7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-質譜聯用法[9,10]、高效液相色譜法和液相色譜-質譜法[11-19]。辣條屬于調味面制品，其中添加了各種調味料、防腐劑、色素等，成分復雜，對微量生物堿的準確測定有很大干擾，但是辣條中罌粟堿的檢測還暫未有人報道，因此建立辣條中罌粟堿的測定方法十分有必要。因此，本研究建立了辣條中5種罌粟堿(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)的超高效液相色譜-串聯質譜的分析檢測方法，供相關監管部門進行參考。

1 試驗部分

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯質譜/質譜儀(UPLC-Quattro Premier XE)、色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) 美國Waters公司；離心機 北京雷勃爾醫療器械有限公司；渦旋混勻器 德國IKA公司；超聲器 Elmasonic S100H公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；固相萃取柱MCX(150 mg/6 mL) 上海安譜公司。

罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因、蒂巴因混合標準溶液：來自上海安譜公司。

實驗室超純水：由Milli-Q純水設備制備；甲醇、乙腈、正己烷、HPLC級試劑，Dikma公司；乙酸、乙酸銨：HPLC級試劑，上海安譜公司；氨水、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗樣品：從泰州市蘇果、大潤發等5家超市、5家農貿市場以及郊區中小學周邊的商店隨機購買辣條樣品共計30份，標簽標示中不含有罌粟殼生物堿。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min;進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A為10 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 5.5)，B為0.1%乙酸乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫表

1.2.2 質譜條件

離子源：正離子模式(ESI+);離子化方式：電噴霧電離；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：500 L/h;錐孔反吹氣流量：50 L/h，質譜條件參數見表2。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取

稱取2 g(精確至0.01 g)均質樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸，振搖混勻，超聲提取10 min，然后于離心機5000 r/min離心5 min，將上清液收集于另一50 mL具塞離心管中，再加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸重復上述步驟，合并2次上清液，加入10 mL正己烷渦旋30 s，然后于5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層待凈化。

1.3.2 凈化

依次用5 mL甲醇、5 mL水活化固相萃取柱，將提取液以2～3 mL/min的速度載入已活化好的MCX小柱，用5 mL水和50%(V/V)甲醇淋洗，棄去全部流出液，減壓抽干5 min以上。然后用8 mL 5%(V/V)氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于15 mL離心管中，氮氣吹干后準確加入甲醇溶解并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后待測。

2 結果與討論

2.1 高效液相色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

以0.1%乙酸水-乙腈為流動相，考察了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)、ACQUITY UPLC BEH HILIC (1.7 μm，2.1 mm×100 mm)3種不同的高效液相色譜柱對各組分分離效果的影響。結果表明：在ACQUITY UPLC HSS T3(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱上得到的分離效果和峰形較好。

2.1.2 流動相的選擇

以HSS T3為色譜柱，以0.1%乙酸水為流動相A，考察了乙腈和0.1%乙酸乙腈作為流動相B對色譜行為的影響，見圖1和圖2。

圖1 0.1%乙酸水-乙腈總離子流圖

圖2 0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈總離子流圖

對比發現圖2中嗎啡和可待因的峰形得到明顯改善，因此以0.1%乙酸乙腈作為流動相B 。結合文獻[12,13]，乙酸銨可以作為流動相之一，我們通過改變乙酸銨的酸堿度來考察對色譜行為的影響。結果發現pH 3.5,4.5,5.5時各組分的保留時間和靈敏度都有較大差別，結果見圖3～圖5。

圖3 乙酸銨pH 3.5的總離子流圖

圖4 乙酸銨pH 4.5的總離子流圖

圖5 乙酸銨pH 5.5的總離子流圖

由圖3可知，乙酸銨pH 3.5時，5種物質未得到較好的分離，對比圖4和圖5發現，乙酸銨pH 5.5時，5種物質的分離效果較好，并且嗎啡、可待因、那可丁的靈敏度都有較大提高。這可能與生物堿的化學性質有關，生物堿大多是氮雜環結構，具有一定的堿性，在水中難溶，只有酸化成鹽后才易溶于水，然后在堿性條件下溶于有機溶劑。因此，待測物在色譜柱上的保留程度受流動相pH的影響較大，并且會影響到離子化效率。根據水中弱堿性化合物解離平衡方程可以得出，目標物的離子化程度與pH值有關，其pH值必須小于其pKa值2個單位才可以保證目標物完全離子化，而這5種目標物的pKa范圍為6.24～8.21。因此，各化合物的色譜峰在pH值為5.5時達到較好的分離效果是符合該理論的。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 提取方法的選擇

辣條屬于調味面制品，其中添加了各種調味料、防腐劑、色素、動植物油脂等，成分復雜，樣品均勻性差。由于罌粟堿、可待因、蒂巴因、那可丁為堿性有機化合物，嗎啡為兩性有機物，它們都能與酸作用形成鹽溶于水，與堿結合溶于有機試劑。所以，本實驗考察了同一辣條基質空白加相同濃度標準溶液，不同的提取試劑下5種目標物的回收率情況。提取試劑分為兩組，第一組分別選取20 mL 0.1 mol/L HCl溶液、乙腈-HCl(1∶1)、乙腈-水(1∶1)為提取液；第二組選取20 mL 2.5%氨化甲醇、5%氨化甲醇、10%氨化甲醇為提取液；以同一種辣條加標作為平行樣，以上6種試劑作為提取液。第一組試驗中樣品經提取液提取后，通過固相萃取柱進行凈化，有機溶劑洗脫后濃縮上樣；第二組試驗經氨化甲醇提取后，通過正己烷去除油脂，直接濃縮上樣。進樣檢測后得到的各個峰面積比見表3。

表3 不同提取液條件下峰面積比對

由表3可知，第一組使用0.1 mol/L HCl溶液提取時，各目標物質均有最大的響應峰面積；第二組使用5%氨化甲醇為提取液時，各目標物質均有最大的響應峰面積；而第一組和第二組進行縱向比較，結果表明：酸性條件下5種目標物質的響應峰面積更大一些。原因可能是面制品有較強的吸水性，在水相中分散更加均勻，而且目標化合物蒂巴因、罌粟堿、可待因和那可丁呈堿性，嗎啡是兩性化合物，在酸性水溶液條件下很容易形成溶于水的鹽類，提取效率較高。因此，本研究選用稀鹽酸溶液(0.1 mol/L)作為樣品的提取溶劑。

2.2.2 凈化條件的優化

罌粟堿的凈化方法主要有液液萃取法、QuEChERS法和固相萃取法。液液萃取法操作繁瑣并且消耗大量的有機溶劑，不適合高通量檢測，因此本文比較了QuEChERS法和3種不同固相萃取柱對5種生物堿的凈化效果。樣品經5%氨化甲醇提取后，經QuEChERS凈化后直接上樣測定，該方法操作簡單，但基質干擾物多，凈化效果不好，回收率低。另外，我們還考察了3種固相萃取柱富集凈化5種生物堿的效果，基于生物堿在酸性提取液中呈陽離子狀態，樣品經稀鹽酸提取后，分別過MCX、WCX、HLB柱，分析結果見圖6。

圖6 不同固相萃取柱對5種生物堿回收率的影響

由圖6可知，提取液經MCX柱吸附、洗脫后取得較好的回收率。因此，我們選用MCX固相柱作為SPE凈化柱。

2.3 基質效應的消除

一般采用超高效液相色譜-串聯質譜進行分析檢測時會有較強的基質效應，日常檢測可以通過添加同位素內標以及配制基質標準溶液來減小基質效應對結果的準確性帶來的影響。由于同位素內標價格昂貴，不適用高通量檢測，因此我們采用配制基質標準溶液來減小基質效應。我們比較了標準溶液和基質標準溶液的信號響應差別，結果表明：基質標準溶液中5種生物堿的信號都有一定程度的抑制，因此配制基質標準工作曲線來進行定量計算是十分必要的。

2.4 標準工作曲線及檢出限

我們以空白基質提取液來配制工作曲線，其中嗎啡和可待因濃度為5，25，50，100，250，500 μg/L，蒂巴因、罌粟堿、那可丁濃度為1，5，10，20，50，100 μg/L。以對照品的濃度(μg/L)為橫坐標，化合物的峰面積為縱坐標，計算得到表4中各個生物堿的線性回歸方程，用于計算實際樣品中待測物的濃度。我們以信噪比(RSN)等于3的原則分別得到5種化合物的檢出限，由信噪比(RSN)等于10的原則分別得到5種化合物的定量限，結果見表4。

表4 5種生物堿的線性范圍、相關系數、方法檢出限和方法定量限

2.5 回收率及精密度

向2 g均質空白辣條樣品中添加高、中、低5種生物堿的混合標準溶液進行加標回收實驗，其中嗎啡、可待因的添加濃度為2.5，12.5，50 μg/kg，蒂巴因、罌粟堿、那可丁的添加濃度為0.5，2.5，10 μg/kg，每個濃度設6個平行樣。回收率及標準偏差結果見表5。

表5 5種生物堿的回收率與精密度測試結果(n=6)

2.6 實際樣品分析

采用試驗方法對市售的30份調味面制品(即辣條)進行測定。結果表明：30批次辣條樣品中未檢出5種罌粟堿成分，這說明目前辣條的生產廠商并無惡意添加罌粟堿的行為。但是隨著近幾年辣條成功走出國門，成為五毛零食界的奇跡，我們的監管部門更需要加大力度對其進行強有力的監管，使得這個奇跡繼續延續下去，保持辣條產業的健康發展。

3 結論

本研究建立了調味面制品(俗稱“辣條”)中5種罌粟堿(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)的超高效液相色譜-串聯質譜的分析檢測法。采用酸溶液超聲提取，固相萃取小柱富集凈化，基質匹配外標法定量。該方法檢出限在0.05～0.5 μg/kg之間，平均回收率為70.2%～103.2%，相對標準偏差為1.7%～8.5%。方法簡便快速，精確度、準確度和靈敏度均較高，可滿足辣條中5種生物堿成分同時測定的要求，為辣條等調味面制品的安全監管提供強有力的技術支持。