響應面法優化血管保健果醋發酵工藝參數

王鋒，孫科

(1.徐州生物工程職業技術學院 生物工程系，江蘇 徐州 221006；2.徐州生物職業技術學院高教研究所，江蘇 徐州 221006)

山楂富含多種有機酸和黃酮類化合物，具有舒張血管、調節心機、增大冠狀動脈血流量、降低膽固醇和降血壓等作用[1]。木耳具有疏通血管、清除血管中膽固醇、降血糖、降血脂、防止血栓形成，預防腦血管疾病的發生等作用[2]。紅棗有很好的增強肌力、消除疲勞、擴張血管、增加心肌收縮力、改善心肌營養等作用[3]。把山楂、木耳、紅棗和生姜按一定比例混合，具有很好的疏通血管、降血壓、降血脂的作用[4]。果醋飲品也具有調節酸堿平衡、降血壓、降血脂、促進血液循環等功效[5]。在山楂果醋的釀造過程中，按比例加入木耳、紅棗和生姜會提高果醋的血管保健作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂、木耳、生姜、紅棗、蔗糖：市售；葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、醋酸菌XZSW001：徐州生物工程職業技術學院生物工程實訓中心保藏；果膠酶：上海玉博生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：上海譜振生物科技有限公司；焦亞硫酸鈉(分析純)：上海宏順生物科技有限公司；MRS培養基：上海創賽科技有限公司；麥芽汁培養基：上海谷研生物科技有限公司。

1.2 設備與儀器

20 L小型發酵罐 鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司；AX324ZH型奧豪斯電子天平 上海奔普儀器科技有限公司；PHS-3C型pH計 上海鼎科科學儀器有限公司；JHY-120ET型酒精計 廈門金河源科技有限公司；PAL-3型糖度儀 深圳市白鰭豚生物科技有限公司；JK-JH01型單人(單面)垂直超凈工作臺 安徽杰克歐德實驗室設備有限公司；小型粉碎機 濟南天宇專用設備有限公司；小型切片機 興化市祥和制藥機械有限公司；小型打漿機 杭州億大科技實業有限公司。

1.3 方法

酒精發酵過程中以酒精產生量(%)和乳酸產生量(g/L)為研究對象，考察了接種量(%)、初始pH值、初始糖度(%)和發酵溫度(℃)4個因素對結果的影響，通過單因素試驗和正交試驗得出酒精發酵的最優發酵條件組合。

醋酸發酵過程中以果醋專家感官綜合評分為研究對象，考察了接種量(%)、酒精濃度(%)和發酵溫度(℃)3個因素對結果的影響，通過單因素試驗和響應面優化方法得出醋酸發酵的最優工藝條件。

1.3.1 工藝流程

1.3.2 酒精發酵試驗

1.3.2.1 乳酸菌接種量的確定

乳酸菌和酵母菌生活條件相似，代謝產物相互影響、相互制約。乳酸菌和酵母菌混菌發酵，可以改良醋酸的口感，增加醋酸的風味。混菌發酵的關鍵是確定二者的比例關系，在酵母菌接種量為2.5%，初始糖度為18%，初始pH值為4.5，發酵溫度為29 ℃的情況下，調整乳酸菌的接種量分別為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，發酵結束后測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.2 初始pH值的確定

乳酸菌和酵母菌都是酸性菌，發酵的pH值相近，混菌發酵時要綜合考慮兩種菌都適宜的pH值。在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，發酵溫度為29 ℃的情況下，設定發酵初始pH值為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，發酵結束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.3 初始糖度的確定

在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，初始pH值為4.5，發酵溫度為29 ℃情況下，設定初始糖度為10%，12%，14%，16%，18%，20%，發酵結束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.4 發酵溫度的確定

在酵母菌接種量為2.5%，乳酸菌接種量為1.5%，初始糖度為18%，初始pH值為4.5情況下，設定發酵溫度為21，23，25，27，29，31 ℃，發酵結束后分別測定酒精和乳酸的含量。

1.3.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇乳酸菌接種量(A)、初始pH值(B)、初始糖度(C)和發酵溫度(D)4個因素，以酒精度為評價指標進行L9(34)正交試驗，從而確定最優的酒精發酵工藝條件。正交因素和水平見表1。

表1 酒精發酵正交因素水平表Table 1 Factors and levels of alcohol fermentation orthogonal test

1.3.3 醋酸發酵試驗

1.3.3.1 接種量的確定

在初始酒精度為9.0%，發酵溫度為32 ℃情況下，設定醋酸菌的接種量分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，發酵結束后計算果醋專家感官綜合評分。

1.3.3.2 初始酒精度的確定

在醋酸菌接種量為8.0%，發酵溫度為32 ℃情況下，調整初始酒精度分別為2%，4%，6%，8%，10%，12%，發酵結束后計算果醋專家感官綜合評分。

1.3.3.3 發酵溫度的確定

在醋酸菌接種量為8.0%，初始酒精度為9.0%情況下，設定發酵溫度分別為24，26，28，30，32，34 ℃，發酵結束后計算果醋專家感官綜合評分。

以醋酸菌接種量、初始酒精度和發酵溫度為影響因素，專家感官綜合評分為考察指標，設計響應面試驗。

1.3.4 測定方法

酒精含量的測定：化學氧化法[6]；乳酸含量的測定：內標氣相色譜法[7]；總糖含量的測定：斐林試劑法；總酸的測定：酸堿中和滴定法。

果醋感官評分見表2[8]。

表2 果醋感官評分表Table 2 Fruit vinegar sensory score

2 結果與分析

2.1 酒精發酵的單因素試驗

2.1.1 乳酸菌接種量對酒精發酵的影響

乳酸菌的接種量對酒精發酵的影響結果見圖1。

圖1 乳酸菌接種量對酒精發酵和乳酸產量的影響Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum size on alcoholfermentation and lactic acid production

由圖1可知，乳酸菌的接種量從0.5%逐步增加到3%時，酒精的產出量逐漸從9.6%減少到5.5%，而乳酸的產生量卻逐漸從1.4 g/L增加到3.3 g/L。當乳酸菌接種量為2.0%時，乳酸菌和酵母菌協同發酵的效果最好，酒精度為7.3%，乳酸產生量為3.1 g/L。是說乳酸菌的接種量為2.0%時，對酒精發酵和乳酸發酵最適宜。

2.1.2 初始pH值對酒精發酵的影響

初始pH值對酒精發酵的影響結果見圖2。

圖2 初始pH值對酒精發酵和乳酸產量的影響Fig.2 Effect of initial pH values on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖2可知，初始pH值從3.0增加到5.5時，酒精的產生量和乳酸的產生量都呈現先增加再減小的趨勢。當初始pH值為4.5時，酒精的產生量和乳酸的產生量同時達到最高值，分別為9.6%和3.3 g/L，即初始pH值為4.5時，對酒精發酵和乳酸發酵最適宜。

2.1.3 初始糖度對酒精發酵的影響

初始糖度對酒精發酵的影響結果見圖3。

圖3 初始糖度對酒精發酵和乳酸產量的影響Fig.3 Effect of initial sugar content on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖3可知，初始糖度從10%增加到20%過程中，酒精的產生量是逐漸增加的，而乳酸的產生量呈現先增加再減小的趨勢。當初始糖度為16%時，酒精的產生量為9.5%，乳酸的產生量為3.3 g/L。酒精度過高或過低都會影響菌種的發酵，所以初始糖度為16%時，對酒精發酵和乳酸發酵最適宜。

2.1.4 溫度對酒精發酵的影響

發酵溫度對酒精發酵的影響結果見圖4。

圖4 發酵溫度對酒精發酵和乳酸產量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation and lactic acid production

由圖4可知，發酵溫度從21 ℃增加到32 ℃過程中，酒精的產生量是先逐漸增加后減小的趨勢但幅度很小，乳酸的產生量也呈現先增加再減小的趨勢，但比較劇烈。當發酵溫度為29 ℃時，酒精的產生量為9.8%，乳酸的產生量為3.4 g/L。酒精產生量和乳酸產生量都達到最大，所以發酵溫度為29 ℃時，對酒精發酵和乳酸發酵最適宜。

2.2 酒精發酵的正交試驗

根據以上的單因素試驗結果，設計正交試驗，以確定最佳的酒精發酵工藝條件，正交試驗設計表見表3。

表3 酒精發酵正交試驗及結果Table 3 Results of orthogonal experiments foralcoholic fermentation

由表3可知，混菌酒精發酵最優的條件組合是：A2B2C2D2，即乳酸菌接種量為2.0%，初始pH值為4.5，初始糖度為16%，發酵溫度為29 ℃。由表3還可知4個因素對酒精產量和乳酸產量影響的順序為：D>A>B>C，即發酵溫度>乳酸菌接種量>初始pH值>初始糖度。對混菌發酵的最優組合A2B2C2D2進行3組平行試驗驗證，發酵結果為酒精度9.6%，乳酸產量3.4 g/L。

2.3 醋酸發酵的單因素試驗

2.3.1 醋酸菌接種量對總酸度的影響

醋酸菌接種量對醋酸發酵的影響結果見圖5。

圖5 醋酸菌接種量對醋酸發酵的影響Fig.5 Effect of acetic acid bacteria inoculation amounton acetic acid fermentation

由圖5可知，發酵液的總酸度隨著醋酸菌接種量的增加逐漸增大，接種量從2%增加到12%的過程中，總酸度從2.9%增大到5.9%。但總酸度的增加呈逐漸變緩趨勢，綜合考慮成本因素，醋酸菌接種量取10%，對醋酸發酵最適宜。

2.3.2 初始酒精度對總酸度的影響

初始酒精度對醋酸發酵的影響結果見圖6。

圖6 初始酒精度對醋酸發酵的影響Fig.6 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

由圖6可知，發酵液的總酸度隨著初始酒精度的增加呈現先增加然后減少的趨勢，初始酒精度為10%時，總酸度最大，為5.9 mL/dL。因為酒精度增加會抑制菌種的活性，所以初始酒精度取10%，對醋酸發酵最適宜。

2.3.3 發酵溫度對總酸度的影響

發酵溫度對醋酸發酵的影響結果見圖7。

圖7發酵溫度對醋酸發酵的影響Fig.7 Effect on fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖7可知，發酵液的總酸度隨著發酵溫度的增加呈現出先增加然后迅速減少的趨勢，發酵溫度為30 ℃時，總酸度最大為5.8 mL/dL，因為溫度增加會抑制菌種的活性，所以發酵溫度取30 ℃，對醋酸發酵最適宜。

2.4 醋酸發酵的響應面試驗[9,10]

2.4.1 醋酸發酵的響應面試驗設計因素與水平

以單因素試驗為依據，設計醋酸發酵的響應面設計因素水平，見表4。

表4 醋酸發酵響應面設計因素水平表Table 4 Factors and levels of response surface methodology on acetic acid fermentation

2.4.2 醋酸發酵的響應面試驗結果與方差分析

醋酸發酵響應面試驗結果見表5。

表5 醋酸發酵響應面試驗設計及結果Table 5 The response surface design and experimental results on acetic acid fermentation

醋酸發酵響應面試驗方差分析見表4。

表6 醋酸發酵響應面試驗方差分析結果Table 6 Results of variance analysis of response surface methodology on acetic acid fermentation

注：“*”表示差異顯著(P<0.05);“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表6可知,模型的P值<0.0001，表明回歸性極顯著；失擬項F值(0.79)>0.05，表明影響不顯著；可行度分析R2=93.62%，表明該模式能夠解釋93.62%的醋酸發酵變化。所以該模型的擬合度較好，實驗的誤差較小，能代替真實的試驗對醋酸發酵工藝條件進行分析預測。由表6可知，發酵參數A,C,A2,C2和BC對最后果醋專家的綜合評分影響極顯著，B和B2專家綜合評分影響顯著，而AB和AC對專家的綜合評分影響不顯著。

2.4.3 醋酸發酵的響應面試驗各因素之間交互作用分析

醋酸發酵各因素之間交互作用對專家綜合評分的影響見圖8～圖10。

圖8 酒精度和接種量對專家評分的影響Fig.8 Effect of alcohol content and inoculum size on the expert evaluation

圖9 溫度和接種量對專家評分的影響Fig.9 Effect of temperature and inoculum size on the expert evaluation

圖10 溫度和酒精度對專家評分的影響Fig.10 Effect of temperature and alcohol content on the expert evaluation

2.4.4 醋酸發酵最優工藝參數確定

以軟件Design-Expert 9.0 對模型進行回歸分析可以發現：當回歸模型值最大時，接種量(A)為9.88%，初始酒精度(B)為10.32%，發酵溫度(C)為30.18 ℃，此時的專家平均評分為98.6分。結合實際情況以及為了操作方便，接種量按10%、初始酒精度按10%、發酵溫度按30 ℃進行3次平行試驗，專家的綜合評分為98.2分，與預測值98.5分非常接近，表明該模型能非常好地預測發酵實際情況。

3 結論

通過單因素試驗確定血管保健醋的酒精發酵影響參數：乳酸菌接種、初始糖度、初始pH值和發酵溫度的大致范圍，然后通過正交試驗確定酒精發酵最優工藝參數：乳酸菌接種量為2.0%，初始pH值為4.5，初始糖度為16%，發酵溫度為29 ℃。在第二階段醋酸發酵過程，首先通過單因素試驗確定醋酸發酵的影響參數：醋酸菌接種量、初始酒精度和發酵溫度的大致范圍，然后通過響應面方法確定醋酸發酵的最優工藝參數：醋酸菌接種量為10%，初始酒精度為10%，發酵溫度為30 ℃。