天然復合香辛料對低鹽四川泡菜內微生物菌系的影響研究

張婷，李曉，許航，唐啟賢，賈利蓉,2，段飛霞,2*

(1.四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065；2.四川大學食品科學與技術四川省高校重點實驗室，成都 610065)

四川低鹽泡菜是以新鮮蔬菜為主要原料，添加(或不添加)香辛料等輔料，用食鹽或食鹽水泡漬發酵，經拌料(調味)、包裝(或不包裝)、滅菌(或不滅菌)等加工而成的蔬菜制品[1]。泡菜中的活性乳酸菌能夠保護胃腸道、增強免疫力[2]，而傳統高鹽腌漬生產工藝會對人體健康和環境產生不利影響，因此低鹽活性益生菌型健康泡菜成為行業發展趨勢。但低鹽腌漬不足以抑制有害微生物的生長，從而導致泡菜風味劣變，亞硝酸鹽積累，嚴重時造成泡菜腐敗。

天然香辛料是四川泡菜加工過程中的常用輔料，具有抑菌、抗氧化、增香等作用[3-7]?，F有研究主要在于香辛料的抑菌作用和機制，對香辛料在低鹽泡菜發酵過程中的選擇性抑菌作用及其對亞硝酸鹽的影響研究較少。本文以辣椒、花椒、大蒜和生姜為研究對象，考察了復合香辛料對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌生長和亞硝酸鹽積累的影響，并通過正交實驗得出最優配比，對低鹽活性益生菌型健康低鹽泡菜的生產有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜、辣椒、花椒、大蒜、生姜：當地(成都)農業公司；食鹽：四川久大制鹽有限公司；孟加拉紅培養基、營養瓊脂培養基：北京奧博星有限公司；MRS培養基：杭州微生物試劑有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺：成都科隆化學品有限公司；腸膜明串珠菌、植物乳桿菌：四川高福記生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

101型電熱恒溫鼓風干燥箱、PYX-DHS-X型隔水式電熱恒溫培養箱、GRP-9160型隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；2XZ-2直聯旋片式真空泵 上海滬析實業有限公司；LDZX-50FB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-1C型醫用超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；pHS-3C型pH計 杭州奧立龍儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；KSK型恒溫水浴鍋 上?？莆鲈囼瀮x器廠；BSA224S型分析天平 上海新航儀器廠；Eppendorf移液器 德國普蘭德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低鹽泡菜的制作工藝

低鹽泡菜的制作工藝流程圖見圖1。

圖1 低鹽泡菜的制作工藝流程圖

1.3.1.1 原料預處理

白蘿卜洗凈、瀝干后切分為2 cm×2 cm×2 cm的小塊；大蒜去皮、清洗、瀝干、切片后備用；辣椒、生姜清洗、瀝干、切片后備用；花椒清洗、瀝干后備用。

1.3.1.2 接種與發酵

采用預滅菌的鹽水與蒸餾水進行低鹽泡菜腌漬。鹽水和蘿卜以2∶1的比例放入廣口瓶中，食鹽終濃度4%，乳酸菌接種濃度5×103cfu/mL，0.1 mm聚乙烯薄膜封口模擬低鹽泡菜實際生產過程中的發酵環境，22 ℃恒溫發酵。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 pH的測定

按照GB 5009.237-2016，用pH計測定低鹽泡菜的pH值。

1.3.2.2 亞硝酸鹽的測定

按照GB 5009.33-2016，用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽的含量。

1.3.2.3 菌落計數

取1 mL發酵液，以1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000梯度稀釋后制備稀釋液。按照GB 4789.35-2016，用0.1 mL稀釋液接入凝固后的MRS瓊脂培養基，37 ℃厭氧恒溫培養48 h后計數為乳酸菌活菌總數；按照GB 4789.15-2010，用0.1 mL稀釋液接入孟加拉紅培養基，28 ℃恒溫培養5天后計數為酵母菌總數；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀釋液于80 ℃加熱10 min后接入瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養48 h后計數為芽孢菌總數；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀釋液接入瓊脂培養基，37 ℃恒溫培養48 h后計數為菌落總數。

1.3.2.4 感官評價方法

采取計分法對各樣品的色澤、質地、風味進行感官評定，外觀、質地、風味的權重分別為0.3，0.2，0.5[8]。外觀評價標準：呈現出蘿卜應有的色澤，湯汁清亮，無浮膜[9]，總分100分；質地評價標準：蘿卜有彈性，咀嚼時口感脆嫩，總分100分；風味評價標準：酸爽可口，香味濃郁，總分100分。綜合評分高于80分，則認為樣品對整體感官品質的影響在可接受范圍內，其濃度范圍可用于后續正交實驗。

1.3.3 單因素實驗及正交實驗

按照圖1所示工藝，在低鹽泡菜發酵至pH 3.5后加入天然香辛料，24 h后檢測低鹽泡菜中乳酸菌、芽孢菌、酵母菌的菌落總數，并與未加天然香辛料的低鹽泡菜做對比。再依據單個香辛料單獨作用的實驗結果，采取 L9(34)的正交實驗方案研究香辛料影響四川低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌和其他微生物生長的協同作用，在此基礎上形成香辛料復配的最佳條件，并評價該條件下低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的消長情況、pH變化趨勢和亞硝酸鹽積累以及低鹽泡菜樣品的感官品質。

2 結果與分析

2.1 單一香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響

2.1.1 辣椒對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響

表1 辣椒對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質的影響

由表1可知，辣椒抑菌效果顯著，辣椒添加量為1.2 g/dL時，對芽孢菌的抑制率大于90%，對酵母菌的抑菌率為85%；當辣椒添加量為2.4 g/dL時，對芽孢菌和酵母菌的抑菌率均大于90%；當辣椒添加量超過4.8 g/dL時，辣味過重，導致低鹽泡菜香氣被掩蔽，色澤變暗，整體感官評分低于80分。結合感官評價和抑菌實驗結果，辣椒添加量在 2.4～4.8 g/dL時，具有較好的抑菌作用，且對低鹽泡菜感官品質無明顯不良影響。

2.1.2 大蒜對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響

表2 大蒜對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質的影響

由表2可知，低鹽泡菜中，大蒜添加量達到6.0 g/dL時，對酵母菌和芽孢菌生長的抑制率均在90%以上。當大蒜添加量達到12.0 g/dL時，整體呈現出濃郁的腌漬大蒜風味，感官綜合評分低于80分。因此，結合感官評價和抑菌實驗結果，認為大蒜的適宜添加范圍為 6.0～10.0 g/dL。

2.1.3 花椒對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響

表3 花椒對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質的影響

由表3可知，花椒對芽孢菌和酵母菌均有抑制作用，且對芽孢菌的抑制效果優于酵母菌。花椒添加量達到1.8 g/dL時，對芽孢菌的抑制率達95%，對酵母菌的抑制率僅為64.9%；當花椒用量增加到3.0 g/dL時，對酵母菌的抑制率僅為66.3%?；ń穼Φ望}泡菜的風味和色澤有較大的影響。當花椒添加量為2.4 g/dL時，低鹽泡菜產生令人不適的麻味，發酵液和蘿卜塊的色澤變為褐色，感官評分低于80分。結合感官評價和抑菌實驗結果，認為花椒單獨作用時應該選擇添加量為0.6～1.8 g/dL。

2.1.4 生姜對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌菌落數和感官品質的影響

表4 生姜對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質的影響

由表4可知，生姜對低鹽泡菜中酵母菌、芽孢菌生長的抑制能力較弱。生姜添加量為12.0 g/dL時，對芽孢菌的抑制率僅為52%，而此濃度下低鹽泡菜已呈現出明顯的澀味，感官綜合評分低于80分。因此，結合抑菌實驗和感官評價結果，生姜的適宜添加量為6.0～10.0 g/dL。

綜上所述，4種香辛料，辣椒、大蒜、花椒、生姜對四川低鹽泡菜發酵過程中酵母菌、芽孢菌的生長均具有不同程度的抑制作用，其對芽孢菌的抑菌能力大小為：辣椒>大蒜>花椒>生姜；對酵母菌的抑菌能力大小為：辣椒>大蒜>生姜>花椒。4種香辛料單獨作用時，對乳酸菌的生長均沒有明顯的抑制作用，辣椒對乳酸菌的生長有微弱的促進作用。

添加量較高時，4種香辛料對低鹽泡菜的感官品質均有不同程度的影響，主要表現在：其特征性風味過于突出，掩蔽低鹽泡菜原有的香氣和滋味，并對低鹽泡菜的色澤產生不利影響。因此，香辛料對低鹽泡菜感官品質的影響限制了其單獨使用時的濃度范圍，因此單一香辛料單獨作用難以抑制低鹽泡菜中有害菌的生長。為同時實現對低鹽泡菜中有害菌的抑制和感官品質的提升，有必要對以上香辛料進行復配。

選擇低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的生長狀況作為測定指標，采用正交實驗對4種香辛料：辣椒(2.4～4.8 g/dL)、大蒜(6.0～10.0 g/dL)、花椒(0.6～1.8 g/dL)、生姜(6.0～10.0 g/dL)的復配方案進行優化。

2.2 復合香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響

正交實驗中，不同配比的復合香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質的影響見表5。

表5 復合香辛料對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質的影響

由極差分析可知，對低鹽泡菜中酵母菌生長影響最大的因素為辣椒添加量，酵母菌抑制率隨辣椒添加量上升而增大；對芽孢菌生長影響最大的因素為花椒添加量，其后依次為辣椒、生姜和大蒜。當復配比例為辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL時，復合香辛料對低鹽泡菜中芽孢菌和酵母菌的抑菌率均達98%以上，低鹽泡菜乳酸菌數為2.0×108cfu/mL，感官綜合評分為90分，低鹽泡菜液澄清，香氣濃郁，口感脆嫩，該復配比例為最佳配比。

2.3 最優配比下的復合香辛料對低鹽泡菜中乳酸菌、pH和亞硝酸鹽積累的影響

按正交實驗最佳配比將4種香辛料復配后，添加到低鹽泡菜中，考察低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌數量、pH值和亞硝酸鹽的積累情況，實驗結果見圖2。

圖2 復合香辛料對低鹽泡菜發酵過程中乳酸菌、pH值和亞硝酸鹽積累的影響

由圖2可知，對照組中乳酸菌在發酵第1天為7.12 log cfu/mL，乳酸菌數隨發酵時間延長而增加，第4天達到峰值7.65 log cfu/mL后有緩慢下降，第7天乳酸菌活菌數為7.01 log cfu/mL。對照組pH值隨發酵時間降低，第1天為5.1，第4天后降低到3.5以下，第7天達到3.0。對照組中亞硝酸鹽的含量隨發酵時間延長不斷增加，第1天為14.51 mg/kg，第4天已達到20.22 mg/kg(高于GB 2762-2017對亞硝酸鹽的限量要求)。

復合香辛料組的乳酸菌生長情況及pH變化情況，與對照組相比無顯著差異。復合香辛料組的亞硝酸鹽含量變化呈先增加后減少的趨勢，在發酵第2天為3.51 mg/kg，第3天達到峰值17.49 mg/kg后快速下降，到發酵第5天降至檢測限以下。

泡菜中亞硝酸鹽的積累主要與泡菜原料的種類、泡菜液的氧濃度、pH、乳酸菌活菌數和產硝酸鹽還原酶的雜菌數量有關。低鹽泡菜對照組中，由于缺乏高濃度食鹽對微生物生長的抑制作用，酵母菌、芽孢菌等具有硝酸鹽還原酶的微生物與乳酸菌共同生長，導致亞硝酸鹽快速積累。而添加復合香辛料的低鹽泡菜，在發酵前期，由于乳酸菌生長緩慢，pH較高，使得酵母菌、芽孢菌等雜菌的生長繁殖盡管受到復合香辛料的抑制，但數量仍然較高，導致亞硝酸鹽積累，達到峰值。在第3天以后，泡菜液環境中氧氣消耗殆盡，乳酸菌數量增加，pH下降，含硝酸鹽還原酶的雜菌生長被復合香辛料顯著抑制，既有的亞硝酸鹽在高酸性條件下被化學降解或被乳酸菌還原降解[10-16]，使得其含量下降，直至為0。

3 結論

通過本文的研究發現，低鹽泡菜在發酵過程中，失去高濃度食鹽形成的高滲透壓的抑菌環境，在發酵初期易出現酵母菌、芽孢菌等有害雜菌的快速生長，不僅導致泡菜品質劣變，同時造成亞硝酸鹽的大量積累，食用后不利于人體健康。通過單因素和正交實驗，優化得到復合天然香辛料抑制低鹽泡菜中有害雜菌生長的最優配比(辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL)，在顯著抑制低鹽泡菜發酵過程中酵母菌、芽孢菌生長的基礎上，不降低低鹽泡菜中活性乳酸菌數量，且能有效降低成熟低鹽泡菜中亞硝酸鹽的含量，有望成為低鹽四川泡菜生產和制作過程中控制微生物污染和防止亞硝酸鹽積累的有效措施。