真空包裝素皮鴨的初始菌相分析與優勢菌初步鑒定

張元嵩，蔣云升，王樂園，瞿文杰

(揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127)

真空包裝素皮鴨是由干豆腐皮經鹵水鹵制，經過蒸煮、冷卻、油炸、浸煮、瀝干等工序后真空包裝而成的即食炸鹵豆腐皮，因其炸鹵后豆腐皮表面顏色類似烤鴨皮，故稱為素皮鴨。豆腐皮中含有45%蛋白質，14%脂肪，且具有人體所需維生素、氨基酸及微量元素，具有高蛋白、低脂肪、易吸收、營養高的特色，成為大多素食產品的主要原料[1]。近年來，由于素食的消費市場逐漸擴大，真空包裝素皮鴨的銷售量也在逐步提高，但因其營養豐富，易為微生物提供生長條件而導致產品脹袋變質，從而限制產品的銷售范圍和貨架期[2]。因此，探究素皮鴨的優勢腐敗菌及菌相構成，從而采取針對性措施以控制其質量安全，成為企業急切需要解決的問題。

本文采用選擇性培養基劃線分離單個菌落，對真空包裝素皮鴨的主要微生物菌群進行純化，依照觀察菌體形態和菌落特征[3]，進行生理生化實驗等方法初步鑒定素皮鴨中的優勢菌，從而為貯藏、運輸、銷售過程中對微生物生長繁殖的有效控制提供理論依據，以達到延長產品貨架期的目的。

1 材料與試劑

1.1 工藝流程

每25 g素皮鴨產品分裝，于4 ℃冷藏7天，隨機取樣進行微生物分析。

1.2 培養基與試劑

選擇培養基：營養瓊脂培養基、Pseudomonades培養基、MRS培養基、VRBGA培養基、MSA培養基、孟加拉紅培養基：購于上海博微生物科技有限公司；革蘭氏染色液、3% H2O2、0.02%甲基紅、格里斯氏試劑等：由實驗室配制；微量生化反應管：購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

冰箱(BCD-203型)；電子天平(DT-200型)；恒溫水浴鍋型(HH-8型)；恒溫恒濕培養箱(HSX-250型)；全溫培養搖床(QYC-200型)；生物顯微鏡(XSP-13A型)；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(YX280B型)；單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-1F型)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9148A型)。

2 方法

2.1 微生物分離與純化

以無菌操作要求，取樣品25 g剪碎，放入225 mL 0.85%無菌生理鹽水中，均質20 min，取1 mL上清液，依次按1∶10遞增稀釋，每個稀釋度做3個重復。采用平板傾注法在45 ℃下培養并每隔24 h進行菌落總數測定。從菌落總數平板上挑取典型生長菌落，在各相應的平板上劃線分離，分離純化2～3次，得到純化的單個菌落，分別接種于相應培養基斜面保存，用于菌種的初步鑒定與觀察。培養基的選擇及培養條件見表1。

表1 各菌的選擇性培養基及培養條件Table 1 Culture media and conditions of different bacteria

2.2 優勢菌鑒定

2.2.1 菌體形態和菌落特征觀察

菌體形態：革蘭氏染色分陰性和陽性；芽孢形狀、著生位置及芽孢囊的形狀。

菌落特征：菌落大小；表面形狀(光滑、皺褶、顆粒狀)；隆起程度(擴展、隆起)；邊緣形狀(整齊、波浪狀、齒輪狀)；菌落形態(單個、成群、鏈狀)；表面光澤；菌落質地(油脂狀、粘稠狀)；菌落顏色(乳白色、蠟黃色、粉紅色、紫紅色、橘紅色)；透明程度(透明、半透明、不透明)。

2.2.2 生理生化實驗

根據《伯杰細菌鑒定手冊》[4]和《常見細菌系統鑒定手冊》[5]對各菌株進行接觸酶實驗、葡萄糖氧化發酵(O/F)實驗、精氨酸脫羧酶實驗、精氨酸雙水解酶實驗、硝酸鹽還原實驗、動力實驗。

3 結果與分析

3.1 優勢菌的初步鑒定

3.1.1 素皮鴨中菌株的菌種特征和菌體形態

通過革蘭氏染色后鏡檢，油鏡觀察各種菌體形態及其在選擇性培養基上的菌種特征，結果見表2。

表2 素皮鴨中分離出的各菌株形態特征Table 2 The morphological characteristics of strains isolated from fried and marinated bean curd stick

3.1.2 生理生化實驗分析

根據《常見細菌系統鑒定手冊》及《伯杰細菌鑒定手冊》，通過油鏡觀察的菌體形態、革蘭氏染色情況等，結合表3的生理生化實驗結果，初步鑒定：X1為芽孢桿菌，X2為腸桿菌，X3為假單胞菌，X4為乳酸菌，X5為葡萄球菌。

表3 素皮鴨中各類菌種的生理生化實驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains from fried and marinated bean curd stick

注：+表示陽性；-表示陰性；/表示未實驗。

3.2 素皮鴨的初始菌相構成

測定真空包裝素皮鴨的細菌菌落數達2.8×105cfu/g，其初始菌落菌相構成見圖1，素皮鴨樣品的初始菌相以乳酸菌(39%)、假單胞菌(29%)和腸桿菌(24%)為主，其次為球菌(5%)和酵母菌(3%)。

圖1 素皮鴨初始菌相構成Fig.1 Original bacterial flora composition of fried and marinated bean curd stick

3.3 素皮鴨保藏過程中各類菌群的變化

真空包裝的素皮鴨成品在4 ℃保藏過程中各類菌群的變化見圖2。

圖2 素皮鴨4 ℃保藏過程中各類菌群變化Fig.2 The changes of several microbial flora in the process of vacuum-packed fried and marinated bean curd stick stored at 4 ℃

由圖2可知，在4 ℃冷藏條件下，真空包裝素皮鴨中乳酸菌、假單胞菌占主導地位，成品最終因乳酸菌、假單胞菌和腸桿菌的大量增長而腐敗變質。

保藏7天中，乳酸菌一直平穩增長，最終成為保藏期間的優勢菌，可能由于乳酸菌不斷產乳酸、醋酸等酸性代謝產物，導致真空包裝素皮鴨腐敗變質后有酸敗味。保藏前2天，假單胞菌緩慢生長，但從第4天開始呈增長趨勢，最終成為真空包裝素皮鴨的第二大優勢菌。Raats D等[6]研究真空包裝的豆腐于3 ℃貯藏，其主要優勢菌為乳酸菌和假單胞菌，這和本實驗的研究結果一致。

腸桿菌雖然增殖緩慢，但仍屬第三大優勢菌，其來源可能是生產環境和生產過程及生產操作人員等。球菌和酵母菌在整個菌相分析過程中，雖然可以測定但兩者含量較低，尤其在腐敗終點時，兩者含量均呈最低值。在保藏前4天，酵母菌一直穩定增長，當第4天達到最高值，第5天開始逐漸下降。球菌在保藏前2天內，仍有增長趨勢，但第3天開始逐漸平穩下降，最終認定球菌和酵母菌不能成為優勢腐敗菌。

4 討論

本實驗從真空包裝素皮鴨中分離出5株菌種，經菌體特征、菌落形態、生理生化實驗分析，初步鑒定：1株芽孢桿菌,1株腸桿菌，1株假單胞菌，1株乳酸桿，1株葡萄球菌。另本實驗中將營養瓊脂平板涂布菌液后于厭氧條件下培養，結果表明平板上無細菌生長，說明此菌為好氧或兼性厭氧，結合菌體特征、菌落形態、生理生化實驗結果，初步判斷素皮鴨中可能帶有芽孢桿菌，彭玲慧等[7]在真空包裝的鹵豆干脹袋后，分離鑒定出1株優勢腐敗菌為蠟樣芽孢桿菌，與本實驗結果較吻合。在4 ℃冷藏條件下，乳酸菌、假單胞菌和腸桿菌是主要的優勢腐敗菌，可為延長素皮鴨貨架期提供研究基礎。