響應面法優化超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝研究

鄭威，于雪飛，王亞立，李春研，李家磊

(1.哈爾濱商業大學生命科學與環境科學研究中心，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業大學圖書館，哈爾濱 150028；3.黑龍江省農業科學院食品加工研究所，哈爾濱 150086)

龍眼葉為無患子科龍眼屬常綠喬木龍眼(DimocarpuslonganLour.)的嫩芽或葉子，為我國廣西地區傳統的藥食同源植物，人們常以茶的形式飲用[1]。我國傳統醫學認為，龍眼葉性味甘平，具有清熱解表、祛濕排毒等作用[2]。現代西方醫學認為，龍眼葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等功效[3-6]。龍眼葉表現出的諸多藥理活性得益于其含有豐富的活性成分，研究表明，龍眼葉主要含有黃酮類、甾醇類和萜類等活性物質，其中尤以黃酮類化合物較為豐富[7]。黃酮類物質作為植物的次生代謝產物，具有很高的藥用價值，對預防癌癥、抗炎鎮痛、免疫調節、降血糖、降血脂、治療冠心病、高血壓、支氣管哮喘以及心絞痛等有顯著效果[8，9]。

目前，人們對龍眼葉的開發利用尚不充分，這就造成了資源的浪費。由于龍眼葉含有豐富的黃酮類物質，因此其可作為提取黃酮類化合物的原料來源。提取黃酮類化合物的方法有很多，主要有溶劑浸提法、勻漿提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法以及超聲輔助提取法[10-14]。由于超聲輔助提取法具有溶劑用量少、提取時間短以及提取率高等特點，因此越來越多的提取工藝采用超聲輔助提取法[15]。鑒于此，本文以龍眼葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，在單因素的基礎上，運用響應面法對超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝進行優化，旨在探索出一種高效的龍眼葉總黃酮的提取工藝，進而為后期綜合利用龍眼葉提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼葉：福建省梅州龍眼葉種植基地；蘆丁標準品(純度≥98%)：成都思特曼生物有限公司；無水乙醇：北京化工有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁：天津市北方天醫化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

KQ-400KDE型高功率超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CARY100型紫外分光光度計 美國Varian公司；XS204型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；DK-98-II A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環水式真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 龍眼葉總黃酮的提取

將新鮮龍眼葉50 ℃烘干，粉碎過60目篩，然后稱取1 g龍眼葉粉置于燒杯中，在一定的提取溫度、液料比、乙醇濃度和提取時間的條件下進行總黃酮的超聲提取，然后將得到的提取液抽濾、定容待測。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁標準品18.9 mg，用95%的乙醇溶解后定容至100 mL的容量瓶中待用；稱取蘆丁標準液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL后置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 1%氯化鋁溶液，用95%的乙醇溶液定容、搖勻，靜置20 min；在410 nm波長處測定吸光值；吸光值測定重復3次，并取平均值，繪制標準曲線；標準曲線的回歸方程為Y=13.566X-0.0258，R2=0.9966。

1.3.3 龍眼葉總黃酮得率的計算

將龍眼葉提取液按1.3.2操作，測得吸光度，由蘆丁標準曲線測得總黃酮質量，龍眼葉總黃酮得率按下式計算。

1.3.4 單因素試驗設計

考察單因素乙醇濃度(10%，30%，50%，70%，90%)，液料比(10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1)，超聲時間(60，90，120，150，180 min)和超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)對龍眼葉總黃酮得率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，以超聲時間、超聲溫度、液料比和乙醇濃度為考察因素，以龍眼葉總黃酮得率為響應值，選用響應面Box-Benhnken 試驗設計對超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝參數進行優化。

1.3.6 數據處理

所有試驗都進行 3 次重復，所得數據以平均值±標準差(SD)表示，采用 Origin 8.5 軟件作圖；響應面Box-Benhnken 試驗采用 Design-Expert V8.0.6.1 軟件進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素對龍眼葉總黃酮得率的影響

2.1.1 乙醇濃度對龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇超聲時間為120 min，超聲溫度為60 ℃，液料比為30∶1，分別用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇溶液進行龍眼葉總黃酮的提取，得率見圖1。

圖1 乙醇濃度對龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from longan leaves

總黃酮的得率隨乙醇濃度的增大先升高后降低。當乙醇的體積濃度達到70%時，總黃酮的得率最大，隨著乙醇濃度的繼續升高，總黃酮的得率呈現下降的趨勢。產生的原因可能是當乙醇濃度過大時，易溶于乙醇溶液的雜質與龍眼葉總黃酮競爭結合乙醇-水分子加劇，加之整個溶液體系粘度增大，導致龍眼葉總黃酮溶出困難，因此，70%的乙醇分數適用于龍眼葉總黃酮的提取溶劑。

2.1.2 液料比對龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇超聲時間為120 min，超聲溫度為60 ℃，乙醇濃度為50%，分別用10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1的液料比提取龍眼葉總黃酮，得率見圖2。

圖2 液料比對龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of total flavonoids from longan leaves

隨著液料比的增加，總黃酮的得率呈先增加后下降的趨勢，當液料比為40∶1時，總黃酮的得率達到最大值。當液料比繼續增加，總黃酮的得率隨之降低，這可能與溶劑的使用量相關，溶劑量增大，樣品的分散程度好，接觸面積變大，利于黃酮物質的溶出，增加得率；溶劑的使用量過大時，一些可能與黃酮結合的雜質溶出，導致總黃酮得率的降低。因此，本試驗的最佳提取液料比為40∶1。

2.1.3 超聲時間對龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，超聲溫度為60 ℃，分別用60，90，120，150，180 min提取龍眼葉總黃酮，得率見圖3。

圖3 超聲時間對龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from longan leaves

當超聲時間為120 min時，龍眼葉總黃酮的得率達到最大值，隨著時間的延長，總黃酮的得率逐漸降低，這可能是由于龍眼葉總黃酮在120 min內已經全部提取完成，若提取時間過長，黃酮易被氧化和降解，導致得率的降低。因此，本試驗的最佳提取時間為120 min。

2.1.4 超聲溫度對龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，超聲時間為120 min，分別用40，50，60，70，80 ℃提取龍眼葉總黃酮，得率見圖4。

圖4 超聲溫度對龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total flavonoids from longan leaves

龍眼葉總黃酮的得率隨溫度的增加先升高后降低，當溫度達到60 ℃時，總黃酮的得率達到最大值。隨著溫度繼續升高，總黃酮的得率逐漸降低，這可能是由于適當地升高溫度可有效地降低溶液體系的粘度，有利于黃酮類物質的擴散和溶解度的增加，然而溫度過高導致黃酮氧化和降解，從而使得龍眼葉總黃酮的得率下降。因此，本試驗的最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應面法確定龍眼葉總黃酮得率的最佳工藝參數

2.2.1 響應模型的建立與分析

本文在單因素試驗的基礎上進行響應面試驗的設計，采用Box-Behnken試驗設計，用自變量A，B，C，D分別代表乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時間4個影響因素，以龍眼葉總黃酮得率為響應值Y。本文設計的試驗因素水平及編碼值見表1，響應面分析方案與結果見表2。

表1 響應面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 響應面分析方案與結果Table 2 Analysis and results of response surface

續 表

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對試驗結果進行二次多項式回歸模型方程擬合，獲得的回歸模型方程如下：

Y=162.23+15.49A+8.09B+8.95C+22.24D-4.18AB-4.59AC-4.79AD-0.76BC-3.52BD-4.89CD-5.56A2-1.63B2-8.13C2-18.02D2。

式中：Y為總黃酮得率，mg/g；A為乙醇濃度，%；B為液料比；C為超聲溫度，℃；D為超聲時間，min。

回歸方程的方差分析結果見表3，模型的P值<0.0001，差異極顯著；失擬項P=0.2968>0.05，差異不顯著；模型確定系數 R2=0.9599；模型調整確定系數Radj2=0.9198；方差分析結果表明模型的擬合度良好，試驗的誤差小，所建模型能夠很好地反映響應值的變化。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

續 表

注：“*”表示顯著差異，P<0.05；“**”表示極顯著差異，P<0.01；R2=0.9599；Radj2=0.9198。

P值可檢查各個因素的顯著性，由P值結果可知，因素 A，B，C，D，C2和D2極顯著，A2顯著，其他因素不顯著，影響程度主次順序為D>A>D2>C>B>A2。

響應面圖是響應值對各試驗因素所構成的三維空間曲面圖，可直觀反映各試驗因素的交互作用及對響應值的相對顯著性。任意2個試驗因素交互作用的響應面圖見圖5。

圖5 任意2個因素交互作用對龍眼葉總黃酮得率影響的響應面圖

由圖5可知，任意2個試驗因素之間均存在明顯的交互作用，并且最佳落點在試驗考察的區域內。

2.2.2 最佳提取條件的確定及驗證

通過對工藝參數的優化，本文建立了以龍眼葉總黃酮提取率為目標值的試驗體系。最佳工藝條件為：乙醇提取濃度90%，液料比48∶1，提取溫度61 ℃，提取時間132 min。在最優的條件下對建立的數學模型進行驗證試驗，結果見表4。獲得的龍眼葉總黃酮的實際測得值為181.83 mg/g，預測值為177.32 mg/g，預測誤差為2.54%，小于5%，因此，證實了預測值的準確可靠。

表4 最優條件的預測值和實測值(n=3)Table 4 The predicted value and measured value of the optimal conditions(n=3)

3 結論

本文以龍眼葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，在單因素的基礎上，運用響應面法對超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝進行優化，確定最佳工藝條件為：乙醇濃度90%，液料比48∶1，提取溫度61 ℃，提取時間132 min。龍眼葉總黃酮得率的預測值為177.32 mg/g，實際值為181.83 mg/g，與優化方案的理論值相接近，表明建立的模型可靠。因此，本文所采用的響應面法優化超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝穩定可靠，該工藝可為龍眼葉的綜合利用及龍眼葉總黃酮的產業化應用提供一定的理論支撐。