清肝祛濕活血方對非酒精性脂肪肝大鼠ERK1/2 磷酸化的影響*

史曉偉，王一強，張玉香，姜德民，王鳳麗，王干一，陳有源，王俊喹

( 1. 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050; 2. 甘肅衛生職業學院，甘肅 蘭州 730000； 3.蘭州市安寧區醫院，甘肅 蘭州 730060； 4.西和縣中醫院，甘肅 西和 742100)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以肝臟中脂肪過度沉積和肝細胞脂肪變性為主要特征、且無過量飲酒史、排除其他肝特異性病因的臨床常見疾病[1]，為肝細胞性肝硬化的重要病因[2]，發病率呈逐年上升趨勢[3]，病情嚴重程度與越來越多的危險因素相關[4]。到目前為止，還沒有一種針對NAFLD的治療被證明是普遍有效的[5]。近年來，中醫藥在治療NAFLD方面發揮了越來越重要的作用，具有多靶點治療、安全可靠的特點，但作用機制尚不完全明確。本研究通過觀察清肝祛濕活血方對NAFLD大鼠空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、游離脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、肝臟細胞外信號調節蛋白激酶1/2(ERK1/2)、肝臟固醇調節元件結合蛋白1c(SREBP-1c)表達的影響，進一步闡明中藥復方治療NAFLD的部分機制、揭示作用靶點，完善中醫藥防治NAFLD的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動 物

選取同批健康SPF級雄性SD大鼠90只，10周齡，體質量(150±20)g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證: SYXK(甘)2011-0001)。實驗前適應性喂養1周，室溫18～20 ℃，標準飼料喂養，自由進食，飲用自來水。

1.2 藥品、試劑與儀器

清肝祛濕活血方處方組成：夏枯草10 g，密蒙花10 g，青葙子10 g，茵陳10 g，垂盆草10 g，丹參15 g，郁金10 g。中藥煎劑由甘肅中醫藥大學藥學實驗室制備，諸藥材由蘭州方正醫藥有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿(商品名：易善復)，由賽諾菲安萬特北京制藥有限公司提供，批號：090266。Rat Insulin ELISA試劑盒(批號E02I0004)和Rat P-ERK1/2 ELISA試劑盒(批號E02P0049)，購自上海藍基生物科技有限公司；Phospho-SREBP 1c Antibody試劑盒(批號9874)，購自美國CST中國分公司產品；FFA ELISA試劑盒(批號TWp003228)和TG ELISA試劑盒(批號TWp028103)，購自上海通蔚實業有限公司。5417R低溫高速離心機，德國EPPENDORF公司產品；BIO-TEK ELX800酶標儀，美國Bio-Rad公司產品；ELITE流式細胞儀，美國BECKMAN-COULTER公司產品。

1.3 動物分組與造模

將90只SD大鼠適應性喂養7 d后按照隨機數字表法分為正常對照組，模型對照組，多烯磷脂酰膽堿組，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組，各組15只。正常對照組予普通飼料喂養；其余各組根據文獻[6]方法，予高脂飼料喂養+腹腔注射四環素造模。

造模成功后，清肝祛濕活血方低、中、高劑量組依次予清肝祛濕活血方生藥5.63，11.25，22.5 g/(kg·d)灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予多烯磷脂酰膽堿550 μg/(g·d)，模型對照組和正常對照組予生理鹽水 10 μL/(g·d)灌胃，連續給藥 30 d。實驗過程中觀察、對比各組大鼠的一般情況。

1.4 檢測指標

實驗結束前大鼠空腹至少 8 h，經鼠尾靜脈采血，使用博士血糖儀測定FPG。經眶后靜脈叢采血，離心取上清，凍存，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測FINS、FFA和TG，并根據FPG及FINS計算出胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。HOMA-IR=胰島素水平(μIU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。取肝臟組織，采用ELISA法測定肝臟ERK1/2，蛋白印記法檢測肝臟SREBP-1c表達。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法

2 結 果

實驗結束時清肝祛濕活血方高劑量組死亡 2只大鼠，中劑量組死亡1只大鼠，解剖后發現是灌胃不當導致窒息而亡。

2.1 各組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠FPG、FINS和HOMA-IR均有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，清肝祛濕活血方各組FPG、FINS和HOMA-IR均有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，多烯磷脂酰膽堿組無統計學意義(P>0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對比，清肝祛濕活血方3個劑量組FPG和FINS水平均明顯下降， HOMA-IR改善明顯，差別有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。說明清肝祛濕活血方能夠顯著改善NAFLD大鼠血糖代謝，胰島功能及胰島素抵抗。見表1。

組別動物數/只FPG/(mmol·L-1)FINS/(μIU·L-1)HOMA-IR正常對照組155.47±1.259.35±6.712.84±0.78模型對照組1513.07±3.43***46.85±13.28***23.75±5.61***多烯磷脂酰膽堿組1512.82±2.93#42.63±10.16#22.76±4.14#清肝祛濕活血方低劑量組159.75±1.55##△△30.24±8.64##△△13.63±2.85##△△清肝祛濕活血方中劑量組148.68±1.41##△△26.52±9.17##△△10.42±2.56##△△清肝祛濕活血方高劑量組137.52±1.24###△△△22.80±6.43###△△△7.38±1.44###△△△

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，#P>0.05，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對比，△△P<0.05，△△△P<0.01

2.2 各組大鼠血清FFA、TG對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠血清FFA和TG均有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，多烯磷脂酰膽堿組和清肝祛濕活血方各組大鼠血清FFA和TG均明顯下降，差別有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對比，清肝祛濕活血方低、中劑量組大鼠血清FFA和TG差別無統計學意義(P>0.05)，清肝祛濕活血方大劑量組有統計學意義(P<0.05)。說明清肝祛濕活血方能夠改善NAFLD大鼠血脂代謝。見表2。

組 別動物數FFA/(μmol·L-1)TG/(mmol·L-1)正常對照組1562.24±4.561.21±0.08模型對照組15220.58±7.14***3.14±0.22***多烯磷脂酰膽堿組15125.32±5.71##1.82±0.17##清肝祛濕活血方低劑量組15136.82±5.13###△2.26±0.21##△清肝祛濕活血方中劑量組14117.36±4.92##△1.79±0.22##△清肝祛濕活血方高劑量組1387.42 ± 4.55###△△1.64±0.13###△△

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對比，△P>0.05，△△P<0.05

2.3 各組大鼠肝臟組織ERK1/2、SREBP-1c表達對比

與正常對照組對比，模型對照組ERK1/2磷酸化增加，SREBP-1c表達升高，差別有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組對比，多烯磷脂酰膽堿組和清肝祛濕活血方各組ERK1/2和SREBP-1c下降，差別有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。與多烯磷脂酰膽堿組對比，清肝祛濕活血方低、中劑量組ERK1/2磷酸化和SREBP-1c表達無統計學意義(P>0.05)，清肝祛濕活血方大劑量組有統計學意義(P<0.05)。說明清肝祛濕活血方能夠降低NAFLD大鼠肝臟內ERK1/2磷酸化，改善SREBP-1c過度表達。見表3。

組 別動物數ERK1/2/(μg· L-1)SREBP-1c/(mg·L-1)正常對照組154.16±0.580.38±0.06模型對照組156.12±0.84***1.24±0.23***多烯磷脂酰膽堿組155.48±0.53##0.76±0.13##清肝祛濕活血方低劑量組155.52±0.61##△0.72±0.10##△清肝祛濕活血方中劑量組145.10±0.49##△0.62±0.11##△清肝祛濕活血方高劑量組134.76±0.68###△△0.54±0.09###△△

注：與正常對照組對比，***P<0.01；與模型對照組對比，##P<0.05，###P<0.01；與多烯磷脂酰膽堿組對比，△P>0.05，△△P<0.05

3 討 論

非酒精性脂肪肝屬中醫學“脅痛”“肝著”“積聚”“肝癖”等范疇?！斗蔷凭灾拘愿尾≈嗅t診療專家共識意見(2017)》[7]認為NAFLD或因飲食不節、或因情志失調、或因稟賦不足、或因勞逸失度、或因久病體虛而導致肝體陰用陽的功能失調、脾腎虧虛，痰、濕、濁、瘀、熱等病理產物積聚而發??；病位在肝，涉及脾、腎等臟腑；臨床推薦按照濕濁內停證、肝郁脾虛證、濕熱蘊結證、痰瘀互結證、脾腎兩虛證5個分型辨證論治。目前研究[8]認為，中藥治療NAFLD的主要作用機制為調節脂肪組織分泌和儲存、改善胰島素抵抗、調節氧化應激等。本課題組認為肝經濕熱瘀阻為NAFLD的主要病機，依此病機自創清肝祛濕活血方，由夏枯草、垂盆草、郁金、茵陳、丹參、密蒙花、青葙子、炙甘草等組成。方中夏枯草、垂盆草、郁金清肝祛濕、活血化瘀，為君藥；茵陳助垂盆草清利肝膽濕熱，丹參助郁金涼血活血，為臣藥；密蒙花、青葙子清肝涼血，為佐藥。全方共奏清肝祛濕、活血化瘀之效。前期臨床研究[9]表明：此方具有改善非酒精性脂肪肝患者臨床癥狀，降低體重指數、腰圍，改善肝功能和胰島素抵抗，調節血脂代謝的作用；動物實驗[10]發現其能夠下調NAFLD大鼠肝臟固醇調節SREBP-1c表達。

西醫學[11]認為二次打擊學說是NAFLD的主要發病機制，其中游離脂肪酸和胰島素抵抗是主要因素。SREBP-1c是主要表達于肝臟和脂肪細胞中的亞型，可調節三酰甘油和磷脂的合成、儲存，其過度表達會調節靶基脂肪酸合酶合成增加。脂肪酸合酶是脂肪酸(FA)合成的關鍵酶，FA能抑制胰島素受體底物胰島素受體底物1的磷酸化，同時下調胰島素受體底物2的轉錄水平，抑制胰島素信號的正常轉導而導致胰島素抵抗[12-13]，形成NAFLD。ERK1/2可通過調節SREBP-1c轉錄因子的核成熟而刺激脂肪酸合酶的表達，且SREBP-1c的表達量隨著ERK1/2磷酸化的增加而增多[14]。本研究顯示，清肝祛濕活血方可有效減少SREBP-1c表達和細胞外信號ERK1/2磷酸化，降低NAFLD大鼠FFA、TG、FPG、FINS和HOMA-IR，改善胰島素抵抗。由此表明，清肝祛濕活血方治療非酒精性脂肪肝的部分機制是通過改善ERK1/2過度磷酸化，降低SREBP-1c表達，從而調節糖、脂代謝，改善胰島素抵抗來實現的。本研究尚未開展清肝祛濕活血方對胰島素信號轉導通路影響干預的研究，是否是清肝祛濕活血方通過降低FA，從而影響胰島素信號轉導通路而致胰島素抵抗還有待進一步研究。