多效唑對水分脅迫下蘋果砧木八棱海棠光合及抗氧化酶活性等生理特性的影響

朱燕芳，王延秀，胡 亞，賈旭梅，郭愛霞

(甘肅農業大學 園藝學院，甘肅 蘭州 730070 )

西北黃土高原地區海拔高、光照充足、晝夜溫差大、生產集中，是我國蘋果的最優生態區，但干旱已成為制約該地區蘋果生長發育的重要因子[1-2]。八棱海棠(MalusrobustaRehd.)因其抗寒抗旱、耐鹽堿、與栽培品種親和力好等優點成為北方蘋果產區的常用砧木[3-4]。 利用抗性砧木及應用外源物質提高蘋果屬植物水分利用效率，是解決蘋果生產中干旱缺水問題的主要方法之一[5]。

多效唑(PBZ)是一種三唑類抑制內源赤霉素合成的高效低毒植物生長調節劑，能夠延緩植物生長，同時增強植物抗逆性[6]。有研究表明，PBZ對飛燕草(Consolidaorientalis)的花期、葉色、花色等有一定的影響[7]，且PBZ能延遲番茄中灰霉菌的生長，增強抗性[8]。玉米、馬鈴薯等作物中，應用PBZ可降低葉片氣孔開度、增加氣孔阻力，減少植物體的蒸騰失水而提高植物葉片的相對含水量和抗旱性[9-10]。在果樹上應用PBZ的研究多集中于水分生理研究，韓振海等[11]認為葉面噴施PBZ，可明顯減少水分脅迫下果樹葉片內游離脯氨酸的含量，增加葉片水勢，提高葉片的抗逆性。關于蘋果砧木在水分脅迫下，PBZ對光合參數和葉綠素熒光參數影響的研究報道較少。本試驗探討了水分脅迫下PBZ對八棱海棠光合特性、葉綠素熒光參數、抗氧化酶、膜脂過氧化、滲透調節物質含量的影響，以期明確PBZ提高植物耐旱性機理，同時為蘋果栽培中應用外源物質提高抗旱性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

試驗于2015年3-9月在甘肅農業大學園藝學院避雨棚進行。 2015年2月1日選取飽滿一致的八棱海棠種子，蒸餾水浸泡12 h后，在4℃進行濕沙處理。3月18日選露白較好、發芽一致的種子播入蛭石中，室溫下培養，待幼苗長至2片真葉時，移入直徑為15 cm、裝200 g營養土(草炭∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1按體積比混合)的花盆中，每盆一株，統一管理。在育苗期間定期澆水、松土、除草。植株具10片真葉時，進行盆栽控水脅迫處理。采用持續稱重法控制土壤含水量，每2天于傍晚稱重并補充水分至最大田間持水量的45%～55%(質量含水量)。對照(CK)處理進行持續控水脅迫，不噴施任何溶液，試驗設5個處理，分別用0 mg·L-1(C0，水溶液不含PBZ)、50 mg·L-1(C1)、100 mg·L-1(C2)、150 mg·L-1(C3)、200 mg·L-1(C4)的PBZ溶液進行噴施處理至滴水為止。每個處理30盆，重復3次，每3天取樣并測定相應的指標。

1.2 試驗方法

1.2.1 光合作用氣體交換參數的測定 從脅迫處理當天開始，之后每隔3天，上午8∶00，用光合儀(Li-6400，LI-COR公司，美國)測定生長一致的幼苗第8片真葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)。設定CO2濃度為400 μmol·mol-1，環境溫度25℃，光強為800 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 光合作用熒光參數的測定 采用光合儀Li-6400測定熒光參數，葉片暗適應后，設置測量光飽和后夾好葉片，等待dF/dt絕對值<5時記錄數據，計算非光化學猝滅系數(NPQ)、PSⅡ的最大光化學效率(Fv/Fm)、PSII的實際光化學效率(ΦPSⅡ)、光化學猝滅系數(qP)等光合與熒光參數；測定重復5次。

1.2.3 生理生化指標的測定 SOD、POD、CAT活性采用李合生[12]的方法測定；電解質滲漏率采用電導率法測定，MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定[12]；脯氨酸含量采用磺基水楊酸法測定[13]。

1.3 數據分析

試驗數據應用Origin 9.0軟件作圖，運用SPSS 22.0軟件進行數據差異顯著性分析和主成分分析。統計分析采用單因素ANOVA的LSD比較差異的顯著水平(α= 0.05)。在主成分分析前，用隸屬函數法對數據進行轉化。

采用模糊數學隸屬函數法對各指標第15天數據進行分析，隸屬函數的計算公式[14-15]：

(1)

反隸屬函數值：

(2)

式中,Xi為指標測定值，Xmin、Xmax為所有參試材料某一指標的最小值和最大值，如果(Xi-Xmin)為負值，則采用(2)式。

2 結果與分析

2.1 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠葉片光合特性的影響

如圖1所示， 隨著水分脅迫的持續八棱海棠葉片的Pn、Gs、Tr呈顯著下降的趨勢，而Ci呈上升趨勢。隨著脅迫時間的延長，對照組Pn下降程度較為明顯；處理15 d后，CK及C0、C1、C2、C3、C4比第0天，分別下降53.72%、50.00%、35.71%、22.28%、32.78%、31.52%，各處理組Pn下降幅度顯著低于對照，C0組與CK的下降幅度基本一致，其中C2(100 mg·L-1PBZ)處理顯著低于其他處理及對照(圖1A)。Gs、Tr的變化與Pn變化相似，水分脅迫15 d后CK及C0、C1、C2、C3、C4的Gs分別下降了60.71%、60.00%、40.06%、36.47%、45.24%、42.68%(圖1B)，Tr分別下降了57.33%、53.42%、41.66%、33.78%、39.43%、43.84%，其中C2處理后的兩指標下降幅度均顯著低于對照及其他處理(圖1C)。處理15 d后，CK及各處理的Ci分別上升了37.12%、37.36%、34.24%、26.98%、36.08%、29.28%，各處理組上升幅度均小于對照組，其中處理組C2上升幅度最小，且顯著低于對照及其他處理組(圖1D)。

圖1 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠光合特性的影響Fig.1 Effect of exogenous PBZ treatment on photosynthetic characteristics on Malus robusta Rehd. under water stress

2.2 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠熒光參數的影響

八棱海棠葉片的Fv/Fm呈緩慢下降的趨勢，說明植株遭受光抑制，CK和C0持續下降，而C1、C2、C3、C4處理組變化較為平緩，表明PBZ處理能提高植株的抗旱能力(圖2A)。隨著水分脅迫時間的延長，為維持光系統的穩定，各處理組NPQ呈上升的趨勢， 在9～15 d，CK和C0的NPQ明顯高于其他處理組，與第0天相比，在第15天對照組及各處理組NPQ升高400.00%、348.28%、212.90%、153.13%、292.86%、266.67%，各處理組上升幅度低于CK(圖2B)。各處理組qP均呈下降趨勢，C2組下降程度最小，為44.62%，說明植株吸收的光能較多地用于光合作用，從而避免光合機構的損壞(圖2C)。 各處理組的ΦPSⅡ在0～9 d，CK及各處理后變化一致，但在9～15 d，各處理組的數值均高于CK。在處理第15天，CK、C0、C1、C2、C3、C4分別比第0天下降51.22%、48.19%、35.00%、30.33%、41.25%、40.74%，說明PBZ處理后能提高PSII光合作用反應中心實際光能捕捉效率(圖2D)。

圖2 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠熒光參數的影響Fig.2 Effect of exogenous PBZ treatment on fluorescence parameters on Malus robusta Rehd. under water stress

2.3 外源多效唑處理對水分脅迫下砧木抗氧化酶活性的影響

由圖3A可知，隨著水分脅迫時間的延長，八棱海棠葉片的POD酶活性逐漸升高，CAT活性和SOD活性呈下降趨勢。與第0天相比，處理15 d后，CK及各處理組分別上升141.94%、132.26%、84.85%、75.00%、73.53%、93.75%，且處理組的降低幅度低于對照組。CK、C0與C1的SOD活性呈現顯著下降；C2在0～3 d短暫的升高，3～9 d持續下降，9～12 d則呈上升，12～15 d顯著下降，C3在0～6 d持續上升，之后顯著下降，C4在0～3 d有短暫升高，之后持續下降。與第0天相比，處理15 d后，CK與各處理組分別下降了40.71%、39.36%、28.94%、21.66%、30.35%、31.96%，其中C2的下降幅度均低于對照及其他處理組(圖3B)。相比SOD，CAT活性下降呈現不同趨勢。隨著脅迫時間的延長，C2的CAT顯著高于CK及其他處理；CK組的CAT活性在0～3 d顯著下降，3～6 d呈緩慢上升趨勢，6～15 d又呈顯著下降的趨勢，而C1、C2、C3、C4均呈緩慢下降趨勢。與第0天相比，處理15 d后，CK和處理組的CAT活性分別下降了52.31%、48.06%、30.33%、31.34%、35.20%、34.65%，處理組與對照組之間存在顯著差異(圖3C)。

2.4 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠滲透脅迫物質含量的影響

圖4顯示，隨著水分脅迫的持續，八棱海棠葉片Pro、REC、MDA總體呈升高趨勢。在圖4A中，C2組MDA含量顯著低于CK和其他處理組，CK和C2在前6天呈上升趨勢，6～9 d有短暫的下降，之后持續上升，C1和C4在前9 d緩慢上升，9～12 d下降，之后升高，C3持續緩慢升高，在處理15 d，CK是C2的1.27倍。與第0天相比，CK及各處理組分別上升80.77%、60.71%、56.60%、37.04%、56.36%、66.67%。脅迫3～15 d，CK組的Pro顯著高于其他處理組，而C2顯著低于對照和其他處理組，在處理15 d，CK是C2的1.63倍，與第0天相比，CK及各處理組分別上升312.50%、246.67%、226.83%、129.55%、166.67%、189.58%(圖4B)。REC的變化與Pro一致，即C2顯著低于CK和其他處理組，在處理15 d，CK是C2的1.42倍，與第0天相比，CK及各處理組分別上升142.86%、113.33%、85.91%、53.85%、93.15%、81.58%(圖4C)。由此可知，八棱海棠Pro、REC、MDA的各個處理組的上升幅度明顯低于對照，其中C2上升幅度最小。說明PBZ處理能有效緩解水分脅迫下滲透脅迫物質的上升。

圖3 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠抗氧化酶活性的影響Fig. 3 Effect of exogenous PBZ treatment on antioxidant enzyme activity on Malus robusta Rehd. under water stress

圖4 外源多效唑處理對水分脅迫下八棱海棠脯氨酸、電導率、丙二醛含量的影響Fig. 4 Effect of exogenous PBZ treatment on proline, relative electrical conductivity, malondialdehyde on Malus robusta Rehd. under water stress

2.5 不同濃度多效唑處理下八棱海棠抗旱能力的綜合評價

2.5.1 利用模糊隸屬函數分析方法對不同濃度多效唑處理下八棱海棠抗旱能力的綜合評價 為了克服單個指標的局限性，全面反映外源多效唑對八棱海棠幼苗的抗旱性影響，對各項指標進行隸屬函數分析。根據其隸屬函數平均值作為抗旱能力鑒定的標準進行排序。由表1可知，C2(100 mg·L-1)處理下八棱海棠幼苗抗旱性最強。

表1 利用模糊隸屬函數法對不同濃度多效唑處理下八棱海棠幼苗抗旱能力的綜合評價Table 1 Comprehensive evaluation of drought resistance of Malus robusta Rehd. under different paclobutrazol concentration treatments using fuzzy membership analysis

2.5.2 利用主成分分析方法對不同濃度多效唑處理下八棱海棠抗旱能力的綜合評價 水分脅迫下，不同濃度PBZ處理，對八棱海棠幼苗葉片14個指標的數據經隸屬函數轉化后進行主成分分析(圖5、表2～4)。由表2和圖5可知，從14個主成分中提取特征值大于1的兩個主成分，其累積貢獻率達93.869%，能夠較好地代表數據所反映的信息。由表3 可以看出，第一主成分對 14 個變量指標的信息提取充分。將上述 2 個主成分的得分值代入綜合評價函數，計算不同濃度PBZ處理的綜合得分，綜合指數的得分越高，說明該處理能有效提高八棱海棠抗旱性。從表4可知，C2濃度處理下，八棱海棠幼苗抗旱性最強，這與模糊隸屬函數分析法結果一致。

圖5 主成分分析碎石圖Fig. 5 The principal component analysis scree plot

表2 主成分列表及方差貢獻率Table 2 List of principle components, percentage of variance,cumulative percentage

3 討 論

逆境下植物光合速率下降，同化產物減少[16-17]。干旱脅迫對植物光合作用的抑制存在氣孔限制和非氣孔限制兩種方式[18]。只有當Ci降低和氣孔限制值增大時，光合速率降低是由于氣孔導度降低所引起的。反之，當葉片光合速率降低且Ci濃度升高，則光合作用的主要限制因素是非氣孔因素[19-20]。本試驗表明不同濃度PBZ處理后，隨著水分脅迫時間的延長，八棱海棠Pn、Gs和Tr均呈下降趨勢，而Ci濃度總體呈上升趨勢，說明光合作用下降主要受非氣孔因素的影響，與牛鐵泉等在蘋果幼苗的研究結果一致[21]。各處理組Pn、Gs、Tr的下降幅度顯著低于對照組，同時Ci的上升幅度均小于對照組，說明PBZ有效緩解了Pn、Gs、Tr的降低，以及Ci的升高，此結論與馮立娟等在大麗花中的研究結果一致[22]，同時PBZ可能是通過調節植株光合系統，減緩各光合指標在逆境下的受抑制程度，使植株能更好適應逆境脅迫，以此來增強植株的抗旱性。

表3 因子負荷矩陣和得分系數矩陣Table 3 Component matrix and score coefficient matrix

表4 利用主成分分析法對不同濃度多效唑處理下八棱海棠幼苗抗旱能力的綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of drought resistance of Malusrobusta Rehd. under different paclobutrazol concenreation treatments using principal component analysis

前人研究表明葉綠素熒光參數會響應非氣孔限制[23]。本試驗中，八棱海棠葉片的Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ均降低，表明隨著水分脅迫時間的延長，植物色素可能受到了不同程度的破壞，使得電子轉換效率下降，同時植物吸收的光能用于光化學反應的比例下降，而NPQ顯著上升，則表明植物散熱能力增強，是植物自我保護的一種機制，這與Mohammed Mouradi 等在紫花苜蓿中研究的結果類似[24]。PBZ處理后其Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ較CK明顯提高，各處理組的下降幅度顯著低于CK，同時NPQ的上升幅度低于CK，表明PBZ緩解了葉綠素熒光參數的降低幅度，減輕其脅迫損傷程度，同時提高了砧木對脅迫的適應能力，這一結果與余凱凱等在馬鈴薯中的研究結果一致[25]。Farzad等也證實qP下降幅度越小，表明植物越抗旱[26]。其中C2處理組，即100 mg·L-1PBZ，葉綠素熒光參數的下降和上升幅度最小，也可反映此濃度下，能及時耗散光合系統中的過剩光能，從而保護PSⅡ反應中心免受因吸收過多光能而引起的光氧化傷害[27]。

超氧化物歧化酶(SOD)是一種清除超氧陰離子自由基的酶，它催化超氧陰離子自由基與氫離子反應產生H2O2和O2，H2O2可由過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用[28]。POD和CAT是植物體中最重要的消除自由基的酶，POD 和CAT活性高低可反映出植物對干旱的抵御能力大小[29]。本試驗中隨著水分脅迫時間的延長，各處理組CAT和SOD總體呈下降趨勢，說明水分脅迫下八棱海棠活性酶系統遭到破壞。而POD酶活性則逐漸升高，表明PBZ處理提高了八棱海棠幼苗的活性氧清除能力。相對而言，PBZ處理以后SOD、CAT下降幅度及POD上升幅度均低于對照組，說明PBZ處理在很大程度上緩解了水分脅迫對八棱海棠抗氧化系統的損傷。

水分脅迫下，植物膜系統遭到破壞，膜內大量的物質外滲，導致植物相對電導率的急劇上升。因此，電導率作為膜透性高低的指標，可用來描述植物抗旱性的強弱[30]。本研究表明，水分脅迫下八棱海棠葉片相對電導率大幅上升，經PBZ處理的植株其相對電導率上升幅度顯著低于對照組，表明PBZ處理能夠有效緩解水分脅迫對膜系統造成的破壞，這與Paul等研究結果一致[31]。游離脯氨酸是一種滲透調節物質，干旱脅迫條件下植物體內會大量積累游離脯氨酸[32]。本試驗中，各個處理組Pro隨處理時間均逐漸升高，說明脯氨酸的積累是干旱脅迫引起的應答反應[33]，MDA與Pro的變化趨勢一致，說明干旱脅迫下膜系統有一定程度的破壞[34]。但PBZ處理后的REC、Pro和MDA的上升幅度總體顯著低于對照，表明外源PBZ處理能提高或增強相關抗逆生理基礎，即提高了滲透調節能力。其中100 mg·L-1PBZ處理下三個指標的上升幅度最小，說明此濃度下對于滲透脅迫物質的上升效果最佳。

通過比較不同指標的變化，反映不同濃度的PBZ對于植株抗旱性的提高，同時本試驗選用模糊隸屬函數分析法和主成分分析法對不同濃度PBZ處理下八棱海棠幼苗抗旱能力進行更進一步的綜合評價[35]。由于不同指標對評價體系的正負影響，采用隸屬函數和反隸屬函數法對各指標數據轉化后進行主成分分析，使結果更為客觀合理[36]。由兩種方法綜合分析排序可知，C2(100 mg·L-1)處理濃度最能有效提高八棱海棠的抗旱性，但C3(150 mg·L-1)和C4(200 mg·L-1)兩處理濃度排序則相反，可能是兩個濃度處理后，由于PBZ濃度偏高，濃度效應不明顯。本試驗中雖選出了PBZ最佳濃度，但PBZ從更深層次對植株的調節機理尚不明確，今后應從基因、蛋白、代謝等各個方面更透徹了解PBZ提高植株抗旱性的機理，以明確PBZ是通過調節植株光合和抗氧化酶系統中哪些相關的基因和蛋白以及代謝產物，為干旱地區果樹栽培提供更有力的理論依據。