青海省不同生態區蠶豆根瘤菌16S rDNA分析

張小娟

(青海大學生態環境工程學院,省部共建三江源生態與農牧業國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

蠶豆不僅是一種重要的糧食作物，同時也是蔬菜、飼料和綠肥。蠶豆作為糧食作物，可為人體提供所必須的蛋白質和其它各類營養物質；蠶豆的根瘤較其它作物大而且多，因此蠶豆享有“生物固氮之王”的美譽[1-2]。蠶豆與禾本科其它作物套種可帶來良好的經濟效益，是“綠色農業”中重要的養地作物。根瘤菌與豆科植物的共生固氮體系是生物固氮中效率最高的體系，約占生物固氮總量的65%。該體系具有固氮能力強、固氮量大、抗逆能力強等特點，可以提高土壤肥力，對可持續農業的發展具有重要的意義[3-7]。蠶豆根瘤菌共生體系是這一體系的成員之一，對其進行廣泛和深入的研究，可以加強對共生固氮的認識。目前國際上對蠶豆根瘤菌有不少的研究，但是對同一品種不同區域共生的根瘤菌研究較少[8-10]。本研究采用16S rDNA全序列分析的方法對青蠶14號蠶豆品種在不同生態區的根瘤菌進行系統發育研究。鑒定篩選共生緊密的根瘤菌為蠶豆根瘤菌的配型及根瘤菌菌劑生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 6-7月在青蠶14號生長地區進行采樣，本研究選擇青海省湟中縣攔隆口鎮及海子溝鄉、共和縣鐵蓋鄉、樂都縣蒲臺鄉、互助縣臺子鄉和西寧市為青蠶14號根瘤菌采樣地，這6個地區為青蠶14號主要栽培區，地理特征上屬于半干旱地區，光照充沛，氣候干燥。除互助縣臺子鄉和樂都縣蒲臺鄉為水澆地外，其余5個地區均為旱地。采集植株高大，根系發達，根瘤較多且根瘤顏色鮮艷、形狀飽滿，體積較大的蠶豆樣本。將蠶豆的根部裝入樣本袋中(不要去掉泥土)，標注好日期地點。-20℃冰箱內保存備用。采樣地區、經緯度及采集的根瘤菌形狀見表1。

表1 供試菌株Table 1 The tested strains

1.1.2 引物 PCR引物選用根瘤菌16S rDNA通用引物。擴增引物序列：P1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’;P2：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC’-3。

1.2 方法

1.2.1 蠶豆根瘤菌的分離和純化 將冰箱中的備用蠶豆樣本取出，用鑷子將根上的根瘤小心剝下，用自來水沖掉泥土，用蒸餾水洗凈并裝入離心管。向離心管中加水至沒過根瘤，浸泡1 h以上，使根瘤充分吸水膨脹。在超凈工作臺中，用95%乙醇浸泡1 min，隨即75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗一次，5%次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水沖洗10次。將表面消毒的根瘤在研缽中碾碎，并加入適量無菌水，攪拌均勻。平板涂布法接入YMA培養基中。28℃培養2～3 d。純化方法采用平板連續劃線法。將長出的根瘤菌用接種環挑出，在YMA平板上連續劃線，培養3～5 d長出單菌落。

1.2.2 蠶豆根瘤菌基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用BioSpin細菌基因組DNA提取試劑盒。基因組DNA檢測：取 2.5 μl PCR 擴增產物與 2.5 μl溴酚蘭混合點樣，0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，在120 V條件下電泳30 min。凝膠電泳成像系統下拍照觀察。

1.2.3 蠶豆根瘤菌16S rDNA的PCR擴增 PCR擴增在Model MG96+基因擴增儀上進行擴增。反應體系(10 μl)：Mix 7 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補足。反應程序為：94℃預變性 5 min，94℃變性30 s，50℃復性45 s，72℃延伸1.5 min， 36 個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增結束后,在反應混合物中加入5 μl溴酚藍,混勻。取7 μl點入含0.5 μg·ml-1溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中,于1×TAE電泳緩沖液中、100 V電場下電泳90 min, 凝膠電泳成像系統下拍照觀察。PCR擴增產物回收：回收采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物技術有限公司生產)。

1.2.4 根瘤菌16S rDNA全序列測定 用于測序的菌株PCR擴增產物回收后直接測序，由上海生工生物技術有限公司完成測序。從GenBank中獲取參比菌株的16S rDNA 序列，數據經編輯后應用MEGA 6進行比對，并利用Neighbor-Joining法構建供試菌株與參比菌株的系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 蠶豆根瘤菌的篩選及基因組DNA電泳結果及16 S rDNA的擴增

首先對采取的根瘤菌樣本進行篩選，從中獲得了6個菌株，即CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6。對這6株根瘤菌提取基因組DNA并進行檢測(圖1)，結果顯示其DNA大小均在20 kb左右，電泳條帶整齊完整，無雜質和RNA污染，可滿足后續實驗的要求。利用根瘤菌16S rDNA通用引物對篩選的6個菌株進行PCR擴增(圖2)。

2.2 供試菌株與各參比菌株之間16 S rDNA基因全序列的相似性

獲得的測序結果，利用DNAstar進行編輯，在 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nib.gov/)比對，從中獲得參比菌株序列，應用MEGA6進行比對，并利用 Neighbor-Joining法構建供試菌株與參比菌株的系統發育樹。

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6圖1 根瘤菌基因組DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis of rhizobium genomic DNA

1. CD1; 2. CD2; 3. CD3; 4. CD4; 5. CD5; 6. CD6圖2 根瘤菌16S rDNA PCR擴增圖譜Fig.2 16S rDNA PCR products of rhizobiums

將6個供試菌株進行擴增回收后測序，將序列與NCBI中已報道的序列進行相似性比對，比對結果如表2。供試6個蠶豆根瘤菌菌株分屬5個不同系統發育分支。其中供試菌株CD4與KF008225.1相似度最高，達到98%，其余均在95%～96%之間。說明同一品種不同區域共生菌株不相同。

2.3 系統發育樹構建

利用MEGA 6.0對供試菌種進行Clustal比對之后(圖3)，與參比菌種進行聚類分析構建參比菌株與供試菌株的N-J樹，從圖4可以看出CD1和CD2共屬同一菌屬，即節細菌屬(Arthrobacter)，CD3屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)，CD4和CD5屬于快生根瘤菌屬(Rhizobium)，CD6屬于中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)。來自不同地區的根瘤菌顯示出很大差異，說明青海省不同生態區根瘤菌種類比較豐富。具體的分類地位還需要進一步研究。

3 討 論

本研究通過同一品種不同生態區6個菌株16S rDNA全序列數據分析和系統發育樹顯示位于5個系統發育分支上。CD1、 CD2同屬一個類群節細菌屬(Arthrobacter)，CD4、CD5同屬一個類群快生根瘤菌屬(Rhizobium)，CD3，CD6分別屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)和中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)。4個類群親緣關系較近。

表2 供試菌株與各參比菌株之間16S rDNA全序列的相似性分析Table 2 Similarity between strains in 16S rDNA sequence

圖3 供試菌種序列比對Figure 3 Clustal alignment between tested strains and the reported cultures

圖4 供試菌種與參比菌種系統發育進化樹Fig.4 Phylogentic tree based on aignment of the known cultures and tested strains

同一寄主在不同環境條件下共生了不同的菌種，說明青海不同區域有著不同的根瘤菌，其遺傳多樣性比較豐富。目前16S rDNA全序列分析是較為普遍及準確的確定根瘤菌系統發育研究的方法，一般來說，菌種相似度在95% 以上可以認為是同一個種，但是在本研究進行過程中發現相似度最高的菌種有時并不是根瘤菌屬，而其他文獻對此現象也有報道[4]。因此在確定其分類地位時還要結合DNA同源性分析來決定[9]。

對于青海省蠶豆根瘤菌的研究目前還比較少，本研究分離出來的根瘤菌品種與之前報道過的存在較大差異，對于青海省蠶豆根瘤菌確切的種類及系統發育研究還需進一步擴大樣品數量，收集更多代表性菌株，擴大多樣性。

環境條件對根瘤菌有著深刻影響，包括對根瘤菌的直接影響和通過影響宿主植物間接地影響根瘤菌的遺傳多樣性區域環境條件的改變，既影響著宿主植物的生長，也改變了根瘤菌的生長條件，造成根瘤菌種群變化和數量的增減，因而在同一環境中出現了根瘤菌表型和遺傳型的多樣性。

在本研究中，從各地區分離的蠶豆根瘤菌無論是表型分析還是遺傳型分析都沒有按照地理來源進行聚群、根瘤菌與豆科植物共生關系的建立是細菌、植物及環境三方相互作用的結果，只有適應當地的土壤條件且又有高效固氮及競爭能力的豆科植物根瘤菌共生體才能在該地發揮應有的作用。