來氟米特聯合羥氯喹治療對類風濕關節炎患者外周血IL—17、IL—23、TGF—β表達的影響

黃彩紅 王小超

【摘要】 目的 研究來氟米特聯合羥氯喹治療類風濕關節炎（RA）患者外周血中白細胞介素（IL）-17、IL-23、轉化生長因子β（TGF-β）的表達及臨床意義。

方法 選取2015年10月～2017年10月確診的初診RA患者50例為觀察組，選取50例在門診體檢中心健康體檢者為健康對照組。所有患者均給予口服來氟米特聯合硫酸羥氯喹治療，觀察3個月。治療前1天及治療后第3個月收集患者血清，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測細胞因子IL-17、IL-23、TGF-β的表達水平，同時收集患者血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF），并記錄腫脹關節數（SJC）、壓痛關節數（TJC）等臨床資料。分析比較兩組間IL-17、IL-23、TGF-β表達水平的差異，研究來氟米特聯合羥氯喹治療RA患者前后免疫細胞因子的變化特點，探討其可能的作用機制。結果 RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β水平明顯高于健康對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。經治療3個月后，RA患者外周血IL-17、IL-23、TGF-β的表達水平與治療前相比明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。RA患者外周血中ESR、CRP、RF明顯高于健康對照組（P<0.05）；治療后其水平明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05），關節疼痛數、關節腫脹數與治療前比較明顯降低（P<0.05）。結論 RA患者外周血IL-17、IL-23、TGF-β的表達水平高于正常人群，經來氟米特聯合羥氯喹治療3個月后，其表達水平明顯下降，且臨床觀察指標也明顯降低，提示來氟米特聯合羥氯喹治療可緩解RA的臨床癥狀，同時可降低IL-17、IL-23、TGF-β細胞因子的表達水平。

【關鍵詞】 來氟米特；羥氯喹；類風濕關節炎；白細胞介素-17；白細胞介素-23；轉化生長因子β

中圖分類號： R593.22 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.005

【Abstract】 Objective To study the expression and clinical significance of leflunomide combined with hydroxychloroquine in peripheral blood interleukin-17 （IL-17），interleukin -23 （IL-23） and transforming growth factor β （TGF-β） in patients with rheumatoid arthritis（RA）.Methods 50 patients with newly diagnosed RA from October 2015 to October 2017 were selected as observation group，and 50 cases from the medical check-up center of our hospital were selected as control group.All patients were treated with leflunomide combined with hydroxychloroquine sulfate for 3 months.The serum levels of the patients were collected 1 day before treatment and at the third month after treatment.The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.Meanwhile，erythrocyte sedimentation rate （ESR），C-reactive protein （CRP） and rheumatoid factor （RF） of the patients were collected，and clinical data like swollen joint count （SJC） and tender joint count（TJC） were recorded.The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β between the two groups were analyzed and compared，the changes of immune cytokines in RA patients before and after treatment with leflunomide combined with hydroxychloroquine were studied，and its possible mechanism action was explored.Results The levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in peripheral blood of RA patients were significantly higher than those in the control group，difference was statistically significant（P<0.05）.After 3 months of treatment，the expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in peripheral blood of RA patients were significantly lower than those before treatment，and the difference was statistically significant（P<0.05）.The ESR，CRP and RF in peripheral blood of RA patients were significantly higher than those in the control group（P<0.05），and the above-mentioned levels of the patients were significantly lower after treatment，the difference was statistically significant（P<0.05）.The number of joint pain and joint swelling significantly reduced compared with those before treatment（P<0.05）.Conclusion The expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β in the peripheral blood of RA patients are higher than those of healthy people.After 3 months of treatment with leflunomide combined with hydroxychloroquine，the expression levels obviously decrease，and the clinical observation indexes also significantly decrease.These results suggest that leflunomide combined with hydroxychloroquine can relieve the clinical symptoms of RA and decrease the expression levels of IL-17，IL-23 and TGF-β cytokines.

【Key words】 leflunomide；hydroxychloroquine；RA；IL-17；IL-23；TGF-β

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）的主要臨床表現為對稱性侵蝕性多關節炎，為常見的慢性、全身性自身免疫病[1]。目前許多研究認為，自身免疫反應及眾多細胞和細胞因子在RA的發病過程中起著非常重要的作用。研究表明，白細胞介素（IL）-17、IL-23、轉化生長因子β（TGF-β）與RA的發病密切相關[2～3]。研究證實，甲氨蝶呤被認為是傳統有效的抗風濕藥物之一，但由于其不良反應多而常使患者被迫停藥，不能耐受，臨床上使用有一定的局限性。來氟米特（leflunomid，LEF）及羥氯喹（hydroxychloroquin，HCQ）是近年來我國新上市的新型免疫抑制劑，其用于治療RA的安全性相對于甲氨蝶呤要好，不良反應少，已被廣泛用于RA等自身免疫性疾病。其在RA的療效研究備受關注，但對RA患者細胞因子的作用研究甚少，本研究通過采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測來氟米特聯合羥氯喹對RA患者治療前后IL-17、IL-23、TGF-β細胞因子水平變化及評估各項臨床試驗指標的影響，為RA的治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年10月～2017年10月在右江民族醫學院附屬醫院風濕免疫科門診就診及住院治療的初診RA患者50例為觀察組，均符合1987年美國風濕病學學會（ACR）類風濕關節炎分類標準[4]，排除患有心、肝、腎基礎疾病，惡性腫瘤、嚴重感染、感染性疾病及合并有其他自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、系統性硬化癥等患者。男16例，女34例，年齡19～66歲，平均（48.0±8.4）歲。病程2～96個月，中位病程30個月。選取在我院體檢中心體檢的健康者50例為健康對照組，其中男22例，女28例，年齡18～62歲，平均（44.6±10.4）歲。兩組的性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

所有患者給予口服來氟米特片（亞邦藥業，國藥準字：H20080420，10 mg×10片/盒）前3天50 mg，每天一次，之后為20 mg，每天一次，聯合硫酸羥氯喹片（上海上藥中西制藥有限公司，國藥準字：H19990263，0.1 g×14片/盒）0.2 g，每天兩次，觀察3個月。且前3個月內未使用抗風濕藥（DMARDs），在治療過程中可適當加用小劑量糖皮質激素（潑尼松≤10 mg/d）或非甾體解熱鎮痛（NSAIDs），觀察期間基本治療方案不變。收集健康者及患者治療前1天和治療后第3個月的外周血，分離血清，采用ELISA檢測免疫細胞因子IL-17、IL-23、TGF-β的表達水平，嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.3 觀察指標

收集患者血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF）及記錄腫脹關節數（SJC）、壓痛關節數（TJC）等臨床資料。

1.4 統計學方法

使用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，各組之間比較采用兩獨立樣本t檢驗，配對資料使用配對t檢驗，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 RA患者與健康對照組外周血中細胞因子水平比較

治療前RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β的表達水平與健康對照組相比顯著增高，差異有統計學意義（P<0.01）；治療后RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β的水平與治療前比較明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 RA患者實驗室及臨床指標變化情況

治療前RA組ESR、CRP、RF水平與對照組相比明顯升高（P<0.01）；治療后患者ESR、CRP、RF及關節疼痛數、關節腫脹數明顯下降（P<0.05），提示治療后病情有所緩解。見表2。

3 討論

RA是較為常見的全身自身免疫性疾病，臨床表現為對稱性關節炎、關節破壞，基本病理改變為滑膜增殖血管翳形成，對關節和軟骨侵蝕破壞，最終致使關節強直、關節功能喪失及畸形，致殘率很高，對人們的生活質量產生嚴重影響。

目前類風濕關節炎的發病機制尚不明確，較多的研究認為是由多種因素共同作用的結果，如環境因素、遺傳易感因素、免疫功能失調等，其中T細胞免疫調節異常是其發病、發展的關鍵因素[5]。輔助性T細胞（Th）根據其產生細胞因子種類不同，分為4個亞群：Th1，Th2，Treg和Th17。目前許多研究認為，Th17/Treg細胞及相關因子在RA的發病過程中起著非常重要的作用。Th17是近期研究發現的一種新型CD4+T細胞亞群，其特異性分泌IL-17而得名[6]，除了IL-17外，其還分泌其他細胞因子。近年來Th17及相關因子IL-17在RA的發生、發展中的作用備受關注。研究發現[7]，在RA患者關節液中IL-17表達增高，可能是其作用于骨及軟骨，并可以促進滑膜血管增生和血管翳形成，從而誘發骨滑膜炎癥、骨和關節損傷。近年文獻報道[8～9]，IL-23是IL-17直接有力的調節因子，它由活化的樹突細胞和巨噬細胞產生，主要在維持Th17細胞活化、分泌和記憶T細胞增殖方面發揮重要作用，且可以促進Th17細胞產生IL-17。有學者在IL-23與RA相關性研究發現，IL-23為一種促炎因子，可作為患者活動性參考指標，且參與RA骨破壞機制[10]。TGF-β與IL-6在Th17的分化過程中起重要作用，IL-6與TGF-β同時存在可促進Th17的分化，TGF-β單獨存在可促使T細胞向Treg分化[11]。TGF-β是一種雙向性、多效性的網絡性細胞因子，既可以促進炎癥作用，又具有抑制炎癥活性作用。新近研究表明[12]，RA患者體內TGF-β水平顯著降低，且活動期改變更顯著，認為TGF-β在RA發病過程中主要發揮負性調節作用，抑制病變的進展。而我們的前期課題組成員研究發現[13]，活動期RA患者血清TGF-β水平表達顯著高于健康者及RA非活動期患者，其在RA的發病中發揮正面的調控作用。本研究結果顯示活動期RA患者外周血中IL-17、IL-23、TGF-β表達水平明顯高于健康對照組，與上述研究一致，進一步證實了這些細胞因子與RA的發病密切相關。

RF是IgG分子Fc片段上抗原表位的特異抗體，在RA中陽性率為60%～80%，約10%的正常人一樣可檢測到，RF在RA的診斷中有重要意義。CRP是一種急性時相反應蛋白，可在炎癥、組織損傷、腫瘤或感染時由肝細胞產生，在早期有較高的表達。ESR加快一般在關節及鄰近組織的炎癥反應發生，在一定程度上可反映病情活動及嚴重性，因此可用于觀察RA病情變化及治療效果。本實驗結果顯示，治療后患者上述指標表達及臨床指標如關節腫脹數、關節疼痛數明顯降低，由此推測來氟米特聯合羥氯喹治療RA可緩解患者病情。

由于RA患者早期可出現關節的破壞，未及時治療可導致關節嚴重畸形，致殘率高，嚴重影響人們的生活質量，因此，早期診斷及早期治療至關重要。目前對于RA的治療主要為緩解癥狀、保護和恢復關節功能，抗風濕類藥物聯合治療仍是目前主要治療方式，傳統的抗風濕治療副作用大，并未達到人們預期的效果，因此，探索安全、有效的聯合方案具有重要意義。甲氨蝶呤為傳統的抗風濕藥之一，其作用機制主要通過抑制二氫葉酸還原酶形成，影響核酸的形成而使細胞DNA合成障礙，從而抑制細胞生長，此外還有抗炎和抗免疫作用。國內有學者研究表明[14～15]，甲氨蝶呤作為多年來治療類風濕關節炎最基礎有效的改善病情藥物，但也是細胞毒性藥物，在體內累積到一定劑量時可產生嚴重的毒性反應，如骨髓抑制、胃腸道反應等，使得不少RA患者不能長期耐受。而來氟米特和羥氯喹是近年來我國新上市的新型免疫抑制劑，已被廣泛用于類風濕關節炎等風濕免疫性疾病的治療[16～17]。來氟米特主要是通過抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性，阻礙DNA和RNA合成，抑制活化淋巴的生長，還可通過抑制酪酸激酶活化而影響淋巴細胞激活及增殖，是具有抗增殖活性的異唑類免疫調節劑。硫酸羥氯喹作為一種4-氨基喹啉類的抗瘧藥，其主要通過阻止炎癥細胞因子釋放白細胞介素及抑制抗原提呈細胞的功能，同時還可抑制溶酶體釋放，抑制吞噬細胞趨化及吞噬功能，抑制成纖維細胞及淋巴細胞的增殖，從而減輕局部炎癥反應及關節癥狀，減少關節畸形的發生。近年來學者研究表明[18]，來氟米特和羥氯喹在治療類風濕關節炎中不良反應少、耐受性好。其在治療類風濕關節炎療效觀察研究備受關注，但其對細胞因子水平的研究甚少，鑒于此本研究通過檢測來氟米特聯合羥氯喹對RA患者治療前后IL-17、IL-23、TGF-β的水平變化及評估各項臨床試驗指標的影響，檢測結果顯示RA患者外周血中IL-23、IL-17、TGF-β水平顯著高于健康對照組，經來氟米特聯合羥氯喹抗風濕治療3個月后，其表達水平明顯下降，所以我們推測來氟米特及羥氯喹可降低RA患者IL-23、IL-17、TGF-β的表達水平，為類風濕關節炎的治療提供理論依據。

綜上所述，來氟米特聯合羥氯喹可改善RA患者的病情，可能通過降低RA患者IL-23、IL-17、TGF-β的表達水平，從而延緩RA疾病進展。

參 考 文 獻

[1] 葛均波，徐永健.內科學[M].8版.北京：人民衛生出版社，2013：808.

[2] 賀微微.Th17相關細胞因子檢測在90例類風濕關節炎中的應用價值[J].檢驗醫學與臨床，2014，11（2）：229-230.

[3] Sun Y，Zhao DL，Liu ZX，et al.Correlation of nuclear factor-κB，regulatory T cell and transforming growth factor β with rheumatoid arthritis[J].Saudi J Biol Sci，2017，24（8）：1849-1852.

[4] Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum.1988，31（3）： 315-324.

[5] Gizinski AM，Fox DA.T cell subsets and their role in the pathogenesis of rheumatic disease[J].Curr Opin Rheumatol，2014，26（2）：204-210.

[6] Morgan ME，Flierman R，Van Duivenvoorde LM，et al.Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells[J].Arthritis Rheum，2005，52（07）：2212-2221.

[7] 楊金娜，劉曉光，李 覃，等.Th17/Treg平衡在類風濕關節炎中作用的研究進展[J].中國藥理學通報，2013，29（8）：1045-1048.

[8] Duan Z，Pan F，Zeng Z，et al.Interleukin-23 receptor genetic polymorphisms and ankylosing spondylitis susceptibility： a meta-analysis[J].Rheumatol Int，2012，32（5）： 1209-1214.

[9] Ogawa R，Suzuki Y，Kagawa S，et al.Distinct effects of endogenous interleukin-23 on eosinophilic airway inflammation in response to different antigens[J].Allergol Int，2015，64： S24-29.

[10] 王乃志，楊麗麗，張 寧.IL-23與類風濕關節炎的相關性研究[J].中國醫科大學學報2012，42（1）：59-61.

[11] 閆慧明，丁利芳，劉 媛，等.轉化生長因子-β1與結締組織生長因子在類風濕關節炎合并肺間質病變患者血清中的表達水平及臨床意義[J].中國全科醫學，2012，15（10A）：3268-3270.

[12] 孟 巖，李明遠，張新玉.類風濕關節炎患者血清IL-21及TGF-β的表達及臨床意義[J].海南醫學，2017，28（21）：3496-3498.

[13] 陸 翔，王小超，陸玉敏，等.類風濕關節炎患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞和白介素17 及轉化生長因子β的表達研究[J].中國全科醫學，2010，13（10）：3355-3357.

[14] 蘭 瑛，胡 蝶，宋海寧，等.甲氨蝶呤治療類風濕關節炎有效性與安全性的系統評價[J].中國藥房，2016，27（21）：2928-2933.

[15] 張 舸，楊群智，付 爽，等.羥氯喹對類風濕關節炎患者關節滑液IL-1α和IL-6表達影響的研究[J].醫學研究雜志，2015，44（9）：100-102.

[16] 胡秋梅.來氟米特治療風濕免疫性疾病的臨床應用研究[J].當代醫藥論叢，2017，15（13）：15-16.

[17] 余春曉，李 杏，孫爾維.羥氯喹抗風濕病的辛路歷程[J].中華風濕病學雜志，2018，22（1）：35-37.

[18] 蘇清芳，曾 瑋，吳廣明.羥氯喹聯合來氟米特治療對老年類風濕關節炎患者血脂的影響[J].中華老年醫學雜志，2015，34（8）：889-892.