RTN4基因外顯子區(qū)拷貝數變異與鼻咽癌的相關性研究

覃海媚 王榮 龐曉霞 凌正寶 劉忠林 胡仁統 王俊利

【摘要】 目的 探討RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數變異（copy number variant， CNV）與鼻咽癌的相關性研究。方法 采用多重基因拷貝數檢測技術（AccuCopyTM）對179例鼻咽癌樣本和200例健康體檢者樣本進行RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數檢測，觀察兩組樣本基因拷貝數變異情況，運用數理統計比較兩組拷貝數分布的差異性。結果 鼻咽癌患者和健康體檢者的RTN4基因外顯子區(qū)的拷貝數主要以2個拷貝為主，經分析發(fā)現這兩組的拷貝數比較差異無統計學意義（P均>0.05）。結論 RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)拷貝數變異可能與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展無相關性。

【關鍵詞】 RTN4基因；外顯子區(qū)；拷貝數變異；鼻咽癌

中圖分類號：R739.63 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.002

【Abstract】 Objective To investigate correlation between copy number variants （CNVs） of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene （54972187-55137831） and nasopharyngeal carcinoma （NPC）.Methods The copy number of 9 target fragments in the exon regions of RTN4 gene of 179 NPC samples and 200 healthy subjects were tested by multiplex gene copy number detection（AccuCopyTM）.Then，CNVs of the two group were observed，and the difference of copy number distribution between the two groups was compared by mathematical statistics.Results The number of copies of RTN4 gene exon in patients with NPC and healthy subjects was mainly two copies，and it was found that there was no statistically significant difference in the number of copies between the two groups（all P>0.05）.Conclusion There may be no correlation between CNVs of the exon region of RTN4 gene （54972187-55137831） and the development of NPC.

【Key words】 RTN4 gene；exon region；CNVs；NPC

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種好發(fā)于頭頸部上皮細胞的惡性腫瘤，發(fā)病率具有明顯的地域聚集性，其發(fā)生機制極為復雜，確切病因仍未完全闡明，給有效防治帶來了極大困難。目前認為，引起鼻咽癌的病因除了EB病毒感染、環(huán)境因素影響之外[1～2]，遺傳因素在鼻咽癌的發(fā)生中也起了重要的作用[3～4]。拷貝數變異（Copy number variants，CNVs）是由基因組發(fā)生重排而導致的，一般指長度為1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數增加或者減少，是各種疾病的遺傳變異的重要來源。已有文獻報道，一些基因CNVs與鼻咽癌、前列腺癌、膠質母細胞瘤、食管癌等[5～8]多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。RTN4基因是一種軸索生長抑制因子，又名Nogo基因（Neurite growth inhibitor），其編碼的蛋白是網狀蛋白家族第四成員（reticulon protein，RTN4），且具有抑制中樞神經系統神經元軸突再生和介導腫瘤細胞凋亡的作用。但RTN4基因CNVs在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中是否起作用，目前尚不清楚。因此，本研究初步探究RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數變異與鼻咽癌的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月～2017年1月來自我院的179例鼻咽癌患者和200例健康體檢者進行實驗研究。其中鼻咽癌組有131例男性和48例女性，平均年齡（47.12±11.38）歲，其納入標準是經病理分析確診為鼻咽癌、未經放療或化療、無親緣關系、無其他疾病。選取200例同階段、年齡匹配的健康體檢者作為對照組，男性144例，女性56例，平均年齡（45.69±12.23）歲，其納入標準是研究對象之間無親緣關系，且臨床體格檢查、實驗室指標都正常，并排除具有遺傳病和其他病史。本實驗經過所有研究對象知情同意，并得到醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本DNA提取

用乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝管收集研究對象3 ml靜脈血備用。按照血液基因組DNA提取試劑盒（北京天根）說明書提取研究樣本的DNA，收集到無菌EP管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RTN4基因拷貝數檢測

本實驗采用上海天昊遺傳分析中心的AccuCopyTM多重基因拷貝數檢測試劑盒對179個鼻咽癌樣本和200個健康體檢者進行9個目的片段拷貝數檢測，并根據實驗要求合成特異引物（見表1）。首先進行PCR擴增：取2 μL基因組DNA模板與2 μL內對照DNA混合液混勻，再加入10 μL模板 2×PCR Master Mix、1 μL多重PCR引物混合液和5 μL ddH2O。PCR擴增反應的循環(huán)程序為95℃ 10 min；11 循環(huán) （94℃ 20s，65℃ 40 s，72℃ 1.5 min）；24循環(huán) （94℃ 20s，59℃ 30s，72℃ 1.5 min）；60℃ 60 min；4℃?zhèn)溆谩U增后將1 μL PCR產物稀釋10倍，再取其中1 μL 與0.5 μL 分子量內對照（GeneScanTM -500 Liz Size Standard）、8.5 μL高度去離子甲酰胺（highly deionized-formamide，Hi-Di）混勻，經95℃變性5 min后上ABI3730XL測序儀進行檢測（重復三次實驗取平均值）。最后，根據相應基因的樣本DNA或者是內對照DNA擴增產物的長度及熒光標記信息，利用GeneMapper 5.0對ABI3730XL測序儀生成的數據文件進行分析。

1.3 統計學方法

運用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本均數t檢驗，計數資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 兩組一般臨床特征的比較

兩組年齡、性別、吸煙、飲酒等臨床特征比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 RTN4基因拷貝數的頻率分布及與鼻咽癌相關性

在所有研究樣本中，RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段的拷貝數變異檢測結果有1拷貝、2拷貝、3拷貝和4拷貝，其中以2個拷貝數占比為主；RTN4基因外顯子區(qū)（E02-03、E05、E06、E07、E08、E09）拷貝數檢測結果均為2，故沒有進行鼻咽癌組和對照組的比較；而RTN4基因外顯子區(qū)E01和E10拷貝數檢測結果有2拷貝和3拷貝；RTN4基因外顯子區(qū)E11拷貝數檢測結果有1拷貝、2拷貝和4拷貝，也以2個拷貝數為主。通過比較鼻咽癌組和正常組RTN4基因外顯子區(qū)（E01、E10、E11）拷貝數分布差異，發(fā)現兩組的拷貝數分布差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。表明RTN4基因（54972187-55137831）外顯子區(qū)9個目的片段的拷貝數變異可能與鼻咽癌發(fā)病風險不存在相關性。

3 討論

RTN4基因位于2號染色體短臂，其長度約75 kb[9]。RTN4基因可通過不同的剪切方式編碼出三種蛋白質，分別是Nogo-A、 Nogo-B和Nogo-C 蛋白。其中Nogo-A蛋白參與抑制中樞神經軸突再生和腫瘤細胞凋亡過程[10]；Nogo-B 高度表達在中樞神經系統和外周組織，其參與腫瘤細胞凋亡、組織損傷修復和血管內皮再生等病理生理過程[11]；而Nogo-C蛋白分子的具體功能目前尚不十分明確。絕大多數鼻咽癌屬于低分化的鱗狀細胞癌，惡性程度極高，其發(fā)病機制尚未明確。隨著人類基因組計劃完成，基因與鼻咽癌的相關性越來越受到廣泛學者的關注[12～14]。我們課題組前期研究發(fā)現RTN4基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性相關，位點rs2588510和rs1348528的單倍型CG、TA可增加鼻咽癌易感性；而rs2864052和rs6545468位點的單倍型AG則可降低鼻咽癌易感性[15～16]。而本研究未發(fā)現RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數變異與鼻咽癌的發(fā)病風險存在關聯性。

Yang L等[17]經TaqMan方法檢測鼻咽癌患者和對照組的絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2（MAPKAPK2）啟動子拷貝數（CNV-30450），發(fā)現CNV-30450拷貝數增加與鼻咽癌患病風險增加有關。認為可能存在的機制是CNV-30450拷貝數增加可以增強MAPKAPK2的啟動子活性，從而提高MAPKAPK2的表達。Tse KP等[5]經利用全基因組SNP陣列和五種CNV預測算法，發(fā)現位于染色體6p21.3的CNV與鼻咽癌患病率增加相關聯。而我們研究顯示鼻咽癌患者RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數分布與對照組比較差異無統計意義，提示 RTN4基因外顯子區(qū)9個目的片段拷貝數變異在鼻咽癌的遺傳發(fā)病機制中不存在相關性。當然本實驗存在一定的局限性：鼻咽癌組和對照組的研究樣本數量相對較小，可能不足以發(fā)現兩者RTN4基因外顯子區(qū)拷貝數變異差異，在今后的研究中我們需要進一步擴大樣本量予以證實。

參 考 文 獻

[1] Turunen A，Rautava J，Grenman R，et al.Epstein-Barr virus （EBV）-encoded small RNAs （EBERs） associated with poor prognosis of head and neck carcinomas[J].Oncotarget，2017，8（16）：27328-27338.

[2] 司勇鋒，陶仲強.鼻咽癌病因學和防治研究[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2010，17（3）：163-165.

[3] Lee AW，Ma BB，Ng WT，et al.Management of Nasopharyngeal Carcinoma：Current Practice and Future Perspective[J].J Clin Oncol，2015，33（29）：3356-3364.

[4] Bruce JP，Yip K，Bratman SV，et al.Nasopharyngeal Cancer：Molecular Landscape[J].J Clin Oncol，2015，33（29）：3346-3355.

[5] Tse KP，Su WH，Yang ML，et al.A gender-specific association of CNV at 6p21.3 with NPC susceptibility[J].Hum Mol Genet，2011，20（14）：2889-2896.

[6] Blackburn A，Wilson D，Gelfond J，et al.Validation of copy number variants associated with prostate cancer risk and prognosis[J].Urol Oncol，2014，32（1）：44.e15-20.

[7] Jamshidi N，Diehn M，Bredel M，et al.Illuminating radiogenomic characteristics of glioblastoma multiforme through integration of MR imaging，messenger RNA expression，and DNA copy number variation[J].Radiology，2014，270（1）：1-2.

[8] Xu E，Sun W，Gu J，et al.Association of mitochondrial DNA copynumber in peripheral blood leukocytes with risk of esophageal adenocarcinoma[J].Carcinogenesis，2013，34（11）：2521-2524.

[9] Oertle T，Schwab ME.Nogo and its partner[J].Trends CellBiol，2003，13（4）：187-194.

[10] 趙紅洋，朱薇薇，王金麗.Nogo-A 蛋白及 Nogo 受體抑制劑防治中樞神經系統疾病的研究進展[J].中國當代醫(yī)藥，2011，18（36）：1920-1927.

[11] 胥武劍，沈國慶，李 強.Nogo-B 的生物學功能[J].生理學報，2013，65（4）：445-450.

[12] Yang ZH，Dai Q，Zhong L，et al.Association of IL-1 polymorphisms and IL-1 serum levels with susceptibility to nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Carcinog，2011，50（3）：208-214.

[13] Yu YF，Han ZG，Guo WB，et al.Interleukin-10 polymorphisms and nasopharyngeal carcinoma risk：a meta-analysis[J].Genet Mol Res，2015，14（4）：18945-18957.

[14] Wang J，Nong L，Wei Y，et al.Association of osteopontin polymorphisms with nasopharyngeal carcinoma risk[J].Hum Immunol，2014，75（1）：76-80.

[15] 覃海媚，王 榮，韋貴將，等.廣西壯族人群RTN4基因多態(tài)性及其單倍型與鼻咽癌易感性的關系[J].腫瘤防治研究，2017，44（3）：221-224.

[16] 覃海媚，王 榮，韋貴將，等.RTN4基因rs2864052和rs6545468與廣西壯族人群鼻咽癌易感性相關研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，30（24）：1942-1945.

[17] Yang L，Liu B，Qiu F，et al.The effect of functional MAPKAPK2 copy number variation CNV-30450 on elevating nasopharyngeal carcinoma risk is modulated by EBV infection[J].Carcinogenesis，2014，35（1）：46-52.