鄰聯茴香胺分光光度法測定飼料添加劑中葡萄糖氧化酶活力

李賢

【摘要】：本方法利用葡萄糖氧化酶能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫在辣根過氧化物酶的作用下氧化鄰聯茴香胺生成水和紅色產物，通過測定產物吸光度變化速率用分光光度法定量計算出葡萄糖氧化酶活力。經研究在酶濃度為0.1～0.5GODU/mL，緩沖液pH為6.0，水浴溫度為30℃的條件下，該方法具有有良好的重現性和穩定性。

【關鍵字】：葡萄糖氧化酶活力；鄰聯茴香胺；分光光度法。

1 引言

葡萄糖氧化酶是一種綠色飼料添加劑，在飼料和畜牧生產中可作為抗氧化劑減緩飼料氧化變質[1]，改善動物腸道微生物平衡[2]，提高飼料利用率[3]，促進動物生長，降低中毒反應更在一定程度上替代抗菌藥物和抗球蟲病藥物，具有廣泛的應用前景。

由于葡萄糖氧化酶的高度專一性，基于不同的酶活定義而建立的檢測方法主要有電化學法、測壓法、凝膠電泳法、滴定法、分光光度法和傅立葉變換紅外光譜法等[4]。電化學法、測壓法、凝膠電泳法存在方法操作復雜，要求嚴格，有很強的儀器依賴性；滴定法存在工作量大、樣品需要量大、人工讀數導致的測量精度低，尤其在混合型飼料添加劑的檢測中不能排除酸性、堿性載體干擾的缺點。傅立葉變換紅外光譜法是較新開發的一種檢測方法，優點為檢測速度快，試劑用量少。缺點為儀器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范圍。因此尋找一種簡便，快捷，靈敏的高的酶活力檢測方法很有意義。

本研究采用鄰聯茴香胺分光光度法測定葡糖糖酶活力。反應機理為：葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，過氧化氫和無色的還原型鄰聯茴香胺在過氧化物酶的作用下生成水和紅色的氧化型鄰聯茴香胺。在一定的pH、溫度、濃度及反應時間內通過測定產物吸光度在460nm波長下的變化速率定量計算出酶活力。基本反應式為：

β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-內酯+H2O

H2O2+鄰聯茴香胺 氧化型鄰聯茴香胺+2H2O

1實驗部分

1.1儀器設備

北京瑞利儀器有限公司UV-2600型紫外可見分光光度計；北京中興偉業儀器有限公司DZKW-2型電熱恒溫水浴鍋；賽多利斯科學儀器有限公司BSA224S型分析天平。

1.2實驗試劑和材料

標示含量為40GODU/g的葡萄糖氧化酶飼料添加劑；辣根過氧化物酶（上海藍季生物）；鄰聯茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氫鈉（國藥試劑）；磷酸氫二鈉（國藥試劑）；葡萄糖（國藥試劑）。

1.3溶液與配制方法

1.3.1磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）：稱取16.61g磷酸二氫鈉和35.82g磷酸氫二鈉溶于無二氧化碳水中，稀釋到1000mL。

1.3.2鄰聯茴香胺甲醇溶液：稱取1g鄰聯茴香胺加在100mL甲醇中攪拌溶解備用。臨用現配。使用時取0.1mL加到上述緩沖液12mL中混勻。

1.3.3 葡萄糖水溶液（180g/L）：稱取18g葡萄糖加在100mL蒸餾水中攪拌溶解。

1.3.4辣根過氧化物酶溶液（0.5mg/mL）：稱取50mg辣根過氧化物酶，用10mL水溶解。

1.4測定方法

稱樣品1.000g置于500mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋，攪拌均勻后，定容至刻度。用快速濾紙過濾，濾液作為樣品溶液（必要時稀釋樣品溶液），取兩只潔凈試管。分別加入鄰聯茴香胺甲醇緩沖液5ml，葡萄糖溶液0.6mL，辣根過氧化物酶溶液0.2mL，置于30℃恒溫水浴中，恒溫后向其中一管中加入0.2mL蒸餾水，作為空白對照在460nm波長處調零。向樣品管中加入0.2mL樣品溶液搖勻，立即在460nm波長處用1cm比色皿在紫外分光光度計中讀取吸光度值，以后每隔1min測定其吸光度，連續測定5min。利用該方法測定時，酶活單位為：在pH=6.0，溫度30℃條件下，每分鐘催化氧化1μmoLβ-D-葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫的量為一個酶活單位用GODU表示。

1.5結果計算

酶活力

式中，△A460：一定時間內460nm處吸光值變化；△t：吸光值變化對應的反應時間，單位為min；11.3：消光系數；V1：樣品定容體積，單位為mL；V2：反應體系體積，6mL；m：樣品稱樣量，單位為g；V3：移取酶液的體積，0.2mL；n：稀釋倍數。

2結果與討論

2.1酶液濃度范圍討論

將待測酶液稀釋分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5GODU/mL依據本實驗2.3實驗條件，分別測定1～4min內平均吸光度變化值△A/△t。并以吸光度變化速率為縱坐標，以酶液濃度為橫坐標作圖，如圖1所示。

從圖1可以看出在酶液濃度為0.1～0.5GODU/mL的范圍內，吸光度變化速率穩定且線性關系良好，相關系數R≥0.999。

2.2緩沖溶液pH值對酶活測定影響的討論

緩沖溶液pH值在3.0～7.0之間變化，其余條件依據本實驗2.3要求進行測定，研究緩沖溶液pH值對葡萄糖氧化酶活力測定的影響，如圖2所示。

從圖2可以看出，在本實驗的緩沖溶液pH值變化范圍內，pH值對結果的影響較為顯著。在pH為6.0時葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法測定葡萄糖氧化酶活力時采用pH=6.0的磷酸鹽緩沖液進行測定。

2.3反應溫度對酶活力測定影響的討論

反應溫度在25～60℃之間變化，其余條件依據本實驗2.3要求進行測定，研究反應溫度對葡萄糖氧化酶活力測定的影響，如圖3所示。

從圖3可以看出，在本實驗的反應溫度變化范圍內，在反應溫度為30℃時葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法測定葡萄糖氧化酶活力時采用30℃作為最佳反應溫度。

2.4反應時間的選擇

依據本實驗2.3要求測定濃度分別為濃度為0.2GODU/mL的酶液，連續測定三次，每次連續測定6min ，分別記錄每分鐘吸光度，結果見表1。

表1中可以看出，在反應的第1min內，反應速度最快且不穩定。當反應時間在1～4min內反應較為穩定，當反應時間到第5min以后反應速率明顯減慢。因此，本方法采用反應時間為第1min與第4min吸光度差作為兩點法[5]的計算數據，進行計算葡糖糖氧化酶酶活力。

結論

綜上所述，采用鄰聯茴香胺分光光度法測定飼料添加劑中葡萄糖氧化酶活力時，在酶液濃度為0.1～0.5GODU/mL，緩沖液pH為6.0，反應溫度為30℃，選取第4min與第1min的吸光度差依據兩點法計算。該方法操作簡便，反應迅速，精密度高，反應系統較為穩定。

【參考文獻】：

[1] 楊久仙，曹靖.葡萄糖氧化酶的應用進展，山西農業大學學報（自然科學版）[J]，2013，33（1）：88-92.

[2] 宋海彬等.葡萄糖氧化酶制劑對肉雞腸道形態結構和消化酶活性的影響，中國畜牧雜志[J]，2010.46（23）：56-59.

[3] 樊霞，肖志明等飼料添加劑葡萄糖氧化酶檢測方法研究進展，農產品質量與安全[J]，2014（6）：21-30.

[4] 熊云霞等.葡糖糖氧化酶在畜牧業中的應用及檢測方法研究進展，飼料工業雜質[J]，2016.37（4）：15-20.

[5] 李丕武，劉瑜，李瑞瑞等，兩種葡萄糖氧化酶測定方法的比較，食品工業科技[J]，2013.（12）：71-74.