四環(huán)素類抗生素降解菌的初篩及鑒定

尹靜

【摘要】：微生物降解是解決抗生素污染的有效途徑，主要是通過微生物的降解作用，將環(huán)境中的抗生素殘留分解成水和二氧化碳，達到弱化其生態(tài)毒性的目的。篩選能夠以四環(huán)素類抗生素為碳源的降解菌株，并對其進行16S rDNA鑒定，為今后深入研究四環(huán)素類抗生素降解菌的降解效果及影響因素奠定基礎。

【關鍵詞】：微生物降解；篩選；降解菌株；鑒定

Abstract： Microbial degradation is an effective way to solve the problem of antibiotic pollution.The main purpose is to decompose the antibiotic residues in the environment into water and carbon dioxide through the degradation of microorganisms， so as to weaken the ecotoxicity. The tetracycline antibiotic-degrading strain was screened and its 16S rDNA was identified， which lays the foundation for further studies on the degradation and influencing factors of tetracycline antibiotic-degrading bacteria in the future.

Key words： microbial degradation； screening； degrading strains； identification

介紹

近年來，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，四環(huán)素類抗生素因其價格低廉、效果顯著等優(yōu)點被廣泛使用。但由于該類抗生素在動物體內(nèi)的吸收率較低，絕大部分會隨著動物排泄物進入環(huán)境，并在環(huán)境中不斷積累，對環(huán)境安全和人體健康構成巨大的潛在危害 [1]。

處理抗生素污染的方法有很多，主要分為非生物降解和生物降解[2]。非生物降解主要是通過物理或化學手段使抗生素降解，如光解、水解和氧化降解等。雖然非生物降解能夠快速去除抗生素殘留，但應用于抗生素降解的化學材料會對環(huán)境產(chǎn)生一定程度的毒副作用[3，4]。生物降解主要包括微生物降解、植物降解以及植物—微生物復合降解[5]，具有低耗、環(huán)保和操作簡單等優(yōu)點，已成為處理抗生素污染的有效途徑。

微生物降解主要是通過微生物的降解作用，將抗生素從大分子物質(zhì)分解成小分為物質(zhì)，直至將其分解完全。因此，篩選出能夠降解四環(huán)素類抗生素的菌株，是解決四環(huán)素類抗生素污染問題的關鍵。本實驗通過篩選能夠以四環(huán)素類抗生素為營養(yǎng)物質(zhì)的菌株，并對其進行16S rDNA鑒定，初步得到四環(huán)素類抗生素降解菌，為今后深入研究四環(huán)素類抗生素的降解效果、最佳降解條件奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本實驗樣品取自北京農(nóng)學院林場的土壤。取樣時，土壤用無菌自封袋裝好，置于-20℃冰箱中待用。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎無機鹽培養(yǎng)基：CaCl2，0.02g； （NH4）2SO4，1.0g；NaCl，0.5g；FeCl3，0.05g；K2HPO4，1.0g；NH4NO3，1.0g； KH2PO4，1.0g；pH=7.0；

微量元素溶液：CoCl2·6H2O ，2g；MnCl2·4 H2O，8.5g；ZnCl2，0.1g；NiCl2·6H2O ，0.2g；CuSO4·5H2O，0.3g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；Na2SeO4·2H2O，0.2g定容至1L容量瓶中待用；

篩選培養(yǎng)基：在滅菌無機鹽培養(yǎng)基中加入土霉素、金霉素和四環(huán)素，根據(jù)試驗需要配置成不同濃度；微量元素添加量為1mL·L-1；

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g ，瓊脂18g，定容至1L，pH=7.2-7.4；

營養(yǎng)培養(yǎng)基：在滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入土霉素、金霉素和四環(huán)素，根據(jù)試驗需要配置成不同的濃度。

1.2 方法

1.2.1 降解菌的篩選

取土壤樣品2.0g，加入含有20 mg·L-1四環(huán)素類抗生素無機鹽培養(yǎng)液的三角瓶中，30℃，150 r·min-1在搖床中黑暗培養(yǎng)7d；取0.5mL培養(yǎng)液，加到四環(huán)素類抗生素濃度為40 mg·L-1的篩選培養(yǎng)基中，30℃，150 r·min-1在搖床中黑暗培養(yǎng)7d。重復以上操作，直至四環(huán)素類抗生素濃度為100 mg·L-1。

1.2.2 降解菌的純化

在四環(huán)素類抗生素濃度為100 mg·L-1的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，用稀釋涂布法和平板劃線法對篩選出的菌株進行分離、純化。

1.2.3降解菌的鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[7]對得到的菌株進行形態(tài)觀察。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對降解菌株進行16S rDNA鑒定。

2 結果與分析

2.1 降解菌的篩選純化及其形態(tài)特征

經(jīng)過篩選和純化，得到1株能夠以四環(huán)素類抗生素為營養(yǎng)來源的降解菌株，該菌在營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落呈圓形，輕微隆起，濕潤，半透明，邊緣整齊、光滑（圖1）。根據(jù)其形態(tài)特征初步判定該菌為細菌。

2.2 降解菌的鑒定

首先對菌株進行基因組DNA抽提、電泳檢測及PCR擴增等處理，然后切膠純化測序并拼接序列，最后在NCBI進行序列比對，找到相似度最高的菌株序列（圖2）。根據(jù)菌株的形態(tài)特征和比對結果初步鑒定該菌為無色桿菌。

討論

通過向無碳源的無機鹽培養(yǎng)液中添加四環(huán)素類抗生素，來馴化、篩選能夠分解利用抗生素進行正常生命活動的菌株，達到降解的目的。雖然篩選得到的菌株能夠在含有高濃度四環(huán)素類抗生素的無機鹽溶液中正常生長，但其降解效果尚不明確。今后，將對所得菌株的降解效果進行深入研究，并探究其對不同濃度抗生素的降解效果。

四環(huán)素類抗生素的穩(wěn)定性以及微生物的生長受溫度、pH等因素的影響，因此有必要研究不同因素對降解菌降解效果的影響，找到最佳降解條件，從而得到能夠同時降解多種四環(huán)素類抗生素的高效菌株。

【參考文獻】：

[1]楊曉洪，王娜，葉波平.畜禽養(yǎng)殖中的抗生素殘留以及耐藥菌和抗性基因研究進展[J].藥物生物技術，2014，21（6）：583-588.

[2]李偉明，明搖，鮑艷宇.四環(huán)素類抗生素降解途徑及其主要降解產(chǎn)物研究進展[J].應用生態(tài)學報，2012，23（8）：2300-2308.

[3]賀德春，許振成，吳根義，等.四環(huán)素類抗生素的環(huán)境行為研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2011，32（4）：98-102.

[4] CABELLO E C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture： a growing problem for human and for the environment [J]. Environmental Microbiology， 2006，8：1137-1144.

[5]劉偉，王慧，陳小軍，等.抗生素在環(huán)境中降解的研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2009，30（3）：89-94.

[6]東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[7]Buchanan RE， Gibbons NE. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition[M]. USA，1994，The Williams&Wilkins; Company.