轉CarNAC1基因可提高棉花的抗旱性

王淑君，曲延英，倪志勇，王莉萍，高文偉，陳全家

(新疆農業(yè)大學農學院,農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

非生物脅迫抑制棉花正常生長發(fā)育，制約產量，降低纖維品質，持續(xù)脅迫可能導致棉株死亡[1]。干旱是當前面臨的主要非生物脅迫[2]。全球干旱地區(qū)耕地面積占總耕地面積的20%左右，約2.74億公頃[3]。棉花是世界性重要的經濟作物，它雖然是較抗旱的作物[4]，但抗旱能力存在品種差異[5]。結合當前嚴峻形勢，培育高抗旱棉花品種，可提高農民經濟效益，促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展[6]。與傳統育種相比，轉基因技術可以通過導入目的基因，定向的改良棉花農藝性狀，提高產量，加速棉花育種進程[7]。然而，關于轉基因提高棉花抗旱性的報道較少[8]。

轉錄因子通過與目標基因啟動子中特定的DNA序列即順式作用元件結合，激活或抑制靶基因的轉錄表達，是基因表達中一類重要的調控因子[9]。研究表明，DREB、MYB、Bzip、鋅指結構等轉錄因子在提高植物脅迫耐受性方面發(fā)揮著重要作用[10]。NAC轉錄因子家族被認為是植物所特有的一類轉錄因子，命名源于矮牽牛NAM和擬南芥ATAF1、ATAF2以及CUC2基因，廣泛存在于各種植物中，而在其他的真核生物中還未發(fā)現[11]。

NAC轉錄因子參與高等植物頂端分生組織的形成、細胞周期的調控、種子和胚的發(fā)育、花藥的發(fā)育、次生根的形成、次生壁的形成、葉片的衰老、激素信號轉導等生物學過程，同時還具有調控逆境脅迫應答的功能[12]。關于NAC基因家族的研究主要集中在水稻[13]、小麥[14]、玉米[15]、大豆[16]、擬南芥[17]、番茄[18]、紫花苜蓿[19]等植物上。

鷹嘴豆是世界第三大豆科作物，主要生長于干旱或者半干旱地區(qū)，其生育期短、抗逆性強、基因組小，在解析植物的抗旱分子機制和挖掘抗旱基因方面具有重要意義[20]。前人從鷹嘴豆中克隆得到CarNAC1基因，并在擬南芥中證明該基因能提高植株抗旱耐鹽能力[21]。本研究對15個穩(wěn)定遺傳的轉CarNAC1基因棉花品系以及受體材料k62，通過室內、室外試驗，比較轉基因棉花品系與受體材料k62在干旱條件下光合指標、生理指標、纖維品質以及產量間的差異，篩選抗旱能力較強的棉花品系。

1 材料與方法

1.1 材料

受體材料K62及經檢測能穩(wěn)定遺傳的15個轉基因棉花品系：ZK62-1、ZK62-2、ZK62-3、ZK62-4、ZK62-5、ZK62-6、ZK62-7、ZK62-8、ZK62-9、ZK62-10、ZK62-11、ZK62-12、ZK62-13、ZK62-14、ZK62-15。新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室提供以上供試材料。

1.2 試驗方案

1.2.1田間試驗 試驗于2016年在石河子144團新疆農業(yè)大學試驗田進行。該地區(qū)無霜期較長，氣候條件適宜棉花種植。5月1日播種，每份材料一膜，株距為10 cm，種植5 m。同一膜相鄰材料以50 cm的走道隔離開來。每個供試材料設兩個處理，處理1正常灌水：全生育期正常澆水；處理2干旱脅迫:于7月5日至7月21日(花鈴期)不澆水，后正常灌水；每個處理均重復3次，該試驗用地面積1.32×103m2。復水前一日測定不同處理下供試材料各項光合指標(均以倒2葉為準)。9月16日(吐絮期)測定農藝性狀，在不同處理下收獲20鈴測定單鈴重和衣分含量，每份材料保存一定量的皮棉樣品送往烏魯木齊棉花質量監(jiān)督檢驗測試中心測定纖維品質。

1.2.2室內試驗 試驗于2016年在新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室進行。通過大田試驗結果選擇抗旱性具有差異的兩個棉花品系：ZK-6、ZK-15以及受體材料K62進行室內試驗。選用飽滿且胚完整的種子，經消毒處理后播種于花盆中，待長出一片子葉后移入裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的塑料盆。水培試驗在光照培養(yǎng)室進行，光周期為12 h/12 h，晝夜溫度為：26～28℃/20～22℃，每2～3 d按時更換營養(yǎng)液保證幼苗健康生長。水培至4～5片真葉時，用15%PEG-6000進行處理，分別在處理0、3、6、12、24 h后采取葉片并測定脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶的含量，每處理重復3次。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 光合生理生化指標 采用英國(漢莎)CIRAS-3便攜式光合測定系統，于7月13日以及7月21日10∶30-12∶30(此時間段為當地測量最佳時間，避免“光合午休”現象)進行光合測量。均以測定倒2葉為準，測定凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)。

1.3.2 農藝性狀指標 每個品系不同處理下連續(xù)測定5株棉花的株高、第一果枝節(jié)位、始節(jié)高、果枝數、有效果枝數、總鈴數、有效鈴數；收取20鈴，計算單鈴重、衣分含量、皮棉產量、籽棉產量。

1.3.3 纖維品質指標 考種后保存的皮棉樣品送至烏魯木齊農業(yè)部棉花質量監(jiān)督檢驗測試中心，測定纖維上半部平均長度、整齊度、馬克隆值、伸長率、短纖維率、紡穩(wěn)參數和斷裂比強度等指標。

1.3.4 生理指標的測定 脯氨酸用茚三酮比色法測定；可溶性糖用蒽酮比色法測定；丙二醛用硫代巴比妥比色法測定；總超氧化物歧化酶用羥胺法測定；過氧化物酶用可見光法測定；過氧化氫酶用分光光度法測定；以上各指標均使用南京建成生物工程研究所訂購的試劑盒測定。

1.4 數據處理及統計方法

所有數據的統計和分析均在SPSS 19.0和Excel 2013上完成，Excel 2013進行繪圖。

數據處理時進行標準化處理，消除遺傳背景對抗旱性研究的影響，參考王艷慧等[22]方法，采用(干旱值/正常值)相對值進行綜合評定。

(1)

(2)

式中,Xi、CKi分別表示干旱、正常處理的性狀測定值。

采用隸屬函數法進行抗旱性綜合評價。隸屬函數值的計算如公式(3)所示。

X(u)=(x-xmin)/(xmax-xmin)

(3)

X(u)反=1-(x-xmin)/(xmax-xmin)

(4)

式中,x為各品種(系)的某一指標測定值，xmax和xmin分別為所有品種(系)某一指標的最大值和最小值。如果某一指標與抗旱(耐鹽)性呈負相關，則用反隸屬函數進行轉換，如公式(4)所示。

綜合指標權重：

(5)

式中,wi為第i個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權重；pi為各基因型第i個綜合指標的貢獻率。

綜合抗旱能力：

(6)

式中，D值為各棉花品系在干旱脅迫條件下用綜合指標評價所得的抗旱性綜合評價值。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對棉花光合指標的影響

由圖1和圖2可看出，干旱脅迫后，轉基因棉花品系氣孔導度顯著降低，均低于受體材料k62；轉基因棉花品系凈光合速率均高于受體材料k62。由此結果說明轉基因棉花品系可能通過降低氣孔導度，來提高棉花品系的抗旱能力。

圖1 干旱脅迫下棉花葉片氣孔導度的變化Fig.1 Changes of stomatal conductance of cotton leaves under drought stress

圖2 干旱脅迫下棉花葉片凈光合速率的變化Fig.2 Changes of net photosynthetic rate of cotton leaves under drought stress

由表1可知，干旱脅迫下，供試材料氣孔導度在98.8～284.2 mmol·m-2·s-1之間，轉基因棉花品系氣孔導度顯著低于受體材料K62，其中轉基因棉花品系ZK62-6的氣孔導度與受體材料K62差異性最顯著，低于受體材料185.4 mmol·m-2·s-1；光合速率在14.93～25.29 mmol·m-2·s-1之間，除ZK62-2外，轉基因棉花品系的光合速率均顯著高于受體材料K62，其中轉基因品系ZK62-6的凈光合速率與受體材料K62差異性最顯著，高于受體材料10.067 μmol·m-2·s-1；

表1 干旱脅迫下轉基因棉花與受體材料光合指標的比較Table 1 Comparison of photosynthetic indexes of transgenic cotton and receptor materials drought stress

注：*代表0.05顯著水平；**代表0.01顯著水平。下同。

Note:*represent 0.05 significant level;**represent 0.01 significant level. The same below.

2.2 干旱脅迫對轉基因棉花農藝性狀和產量性狀的影響

2.2.1 干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料農藝性狀和產量性狀比較 由表2可得，干旱脅迫下，各轉基因棉花品系與受體材料K62性狀差異達顯著水平所占比例分別為：株高占60%、第一果枝節(jié)位占60%、果枝數占53.3%、有效果枝數占20%、總鈴數占20%、有效鈴數占40%、單鈴重占100%。由此可知，干旱脅迫下轉基因棉花品系單鈴重、株高、始節(jié)高、果枝數差異幅度較大。轉基因棉花品系單鈴重均高于受體材料K62，ZK62-15與K62差異最大，平均高于對照0.657g；除ZK62-10外，其它轉基因棉花品系株高均低于受體材料K62，ZK62-5與K62差異最大，平均低于對照8.8 cm；轉基因棉花品系第一果枝節(jié)位均低于受體材料K62，ZK62-6與K62差異最大，平均低于對照7.5 cm；轉基因棉花品系果枝數均多于受體材料K62，ZK62-14與K62差異最大，平均多于對照3.5個。

2.2.2 基于農藝性狀和產量性狀主成分分析 對9個單項指標的抗旱系數進行主成分分析(表3)，前2個綜合評價指標F1和F2的累積貢獻率為76.619%，因此，F1和F2基本能反映9個農藝性狀及產量性狀指標的變化。

2.2.3 基于農藝性狀和產量性狀指標抗旱性綜合評價 由表4可知，CDC值與D值結果基本一致。在干旱脅迫下，大部分轉基因棉花品系綜合抗旱能力均優(yōu)于受體材料k62。綜合抗旱能力排在前三的品系分別為ZK62-10、ZK62-6、ZK62-1。綜合抗旱能力相對較差的品系為：ZK62-13、ZK62-9、ZK62-4。

表2 干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料農藝性狀和產量性狀比較

表3 干旱脅迫下轉基因棉花品系農藝性狀和產量性狀指標因子載荷矩陣及方差貢獻率Table 3 The factor loading matrix and the variance contribution rate of agronomic characterrs and yield traits of transgenic cotton strains under drought stress

表4 干旱脅迫下轉基因棉花品系農藝性狀和產量性狀的D值、CDC值及排序Table 4 D value, CDC value and the rank of agronomic characters and yield traits of transgenic cotton strains under drought stress

2.2.4 基于農藝性狀和產量性狀指標聚類分析 通過最近鄰元素法進行聚類分析，結果如圖3所示，干旱脅迫下，將16個棉花品系分為三類，第一類為極抗旱材料1份：ZK62-10；第二類為中抗旱材料5份：ZK62-1、ZK62-7、ZK62-5、ZK62-3、ZK62-6；第三類為敏感材料10份：ZK62-8、ZK62-11、k62等。

圖3 基于農藝性狀和產量性狀指標D值的聚類Fig.3 Clusters based on D value of agronomic traits and yield

2.3 干旱脅迫對棉花纖維品質的影響

2.3.1 干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料纖維品質比較 由表5可知，干旱脅迫下，各轉基因棉花品系與受體材料K62性狀差異達顯著水平所占比例分別為：紡紗系數占80%、馬克隆值占100%、上半部長度占100%、長度整齊度占73.3%、短纖維率占86.7%、斷裂比強度占80%、斷裂伸長率占93.3%。由此可知，干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料K62在馬克隆值、上半部長度、斷裂伸長率的差異幅度較大。馬克隆值在3.12～5.69之間，其中K62-4與受體材料K62差異性最大，差值為1.79；上半部長度在27.2～30.46 mm之間，其中K62-4與受體材料K62差異性最大，差值為2.0 mm；斷裂伸長率在3.17～6.68 CN·tex-1之間，其中K62-5與受體材料K62差異性最大，差值為2.62 CN·tex-1。

2.3.2 基于纖維品質指標主成分分析 由表6可知，對7個單項纖維品質指標的抗旱系數進行主成分分析，前3個綜合評價指標F1、F2、F3的累積貢獻率為91.395%。因此，前3個綜合評價指標基本能反映纖維品質狀況。

2.3.3 基于纖維品質指標抗旱性綜合評價 由表7可知，CDC值與D值結果基本一致。在干旱脅迫下，大多數轉基因棉花品系綜合抗旱能力均優(yōu)于受體材料K62。干旱脅迫下纖維品質依然能保持較高水平的品系分別為ZK62-6、ZK62-12、ZK62-15。纖維品質受干旱脅迫影響較大的品系為：ZK62-10、ZK62-1、K62。

表5 干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料纖維品質比較

表6 干旱脅迫下轉基因棉花品系纖維品質指標因子載荷矩陣及方差貢獻率Table 6 The factor loading matrix and the variance contribution rate of fiber quality index of transgenic cotton strais under drought stress

表7 干旱脅迫下轉基因棉花品系纖維品質指標的D值、CDC值及排序Table 7 D value, CDC value and the rank of fiber index of transgenic cotton strains under drought stress

2.3.4 基于纖維品質指標聚類分析 通過最近鄰元素法進行聚類分析，結果如圖4所示，干旱脅迫下，將16個棉花品系分為三類，第一類為極抗旱材料3份：ZK62-6、ZK62-12、ZK62-15；第二類為中抗旱材料8份：ZK62-9、ZK62-13、ZK62-11等；第三類為敏感材料5份：K62、ZK62-10、ZK62-3、ZK62-1、ZK62-8。

2.4 室內模擬苗期干旱脅迫對棉花生理指標的影響

由圖5可知，棉花在受到干旱脅迫后，丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、總超氧化物歧化酶活力隨著脅迫時間的增長均呈上升趨勢，過氧化氫酶活力、過氧化物酶酶活力呈現先升高后降低的趨勢。除丙二醛含量為轉基因棉花品系低于受體材料K62外，其余各指標均為轉基因棉花品系高于受體材料K62。

圖4 基于纖維品質指標D值的聚類Fig.4 Clusters based on D value of fiber quality index

由表8可知，棉花苗期在室內進行模擬干旱，轉基因棉花品系與受體材料K62在脅迫24 h時，丙二醛含量差異最大，ZK62-6丙二醛含量比K62低15.534 nmol·ml-1，ZK62-15丙二醛含量比K62低2.869 nmol·ml-1；轉基因棉花品系ZK62-15脯氨酸含量在12 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料5.71 μg·g-1，轉基因棉花品系ZK62-6脯氨酸含量在24 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料12.42 μg·g-1；轉基因棉花品系ZK62-15可溶性糖含量在6 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料2.92 mg·g-1，轉基因棉花品系ZK62-6可溶性糖含量在24 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料6.69 mg·g-1；轉基因棉花品系ZK62-15過氧化氫酶活性在12 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料6.91 U·mg-1，轉基因棉花品系ZK62-6過氧化氫酶活性在干旱脅迫3 h時，與受體材料K62差異最大，高于受體材料18.27 U·mg-1；轉基因棉花品系ZK62-15超氧化物歧化酶活性在干旱脅迫24 h時，與受體材料K62差異最顯著，比受體材料高33.17 U·mg-1，轉基因棉花品系ZK62-6超氧化物歧化酶活性在干旱脅迫12 h時，與受體材料K62差異最顯著，比受體材料高65.65 U·mg-1；轉基因棉花品系過氧化物酶活性在干旱脅迫24 h時，與受體材料K62差異最顯著，ZK62-15比受體材料高85.88 U·mg-1，ZK62-6比受體材料高208.95 U·mg-1。

圖5 干旱脅迫下棉花生理指標隨脅迫時間的變化Fig.5 Changes of physiological indexes of cotton with stress time under drought stress

表8 干旱脅迫下轉基因棉花品系與受體材料生理指標的比較Table 8 Comparison of physiological indexes of transgenic cotton and receptor materials under drought stress

3 討 論

干旱是影響植物生長發(fā)育的重要逆境因子。研究發(fā)現[23]，NAC轉錄因子直接參與或通過調節(jié)參與干旱、高鹽、冷害應答基因的表達，在植物非生物逆境脅迫中起重要作用。本研究通過多角度實驗證明，在棉花生長關鍵期——花鈴期遭遇干旱時，轉CarNAC1基因棉花抗旱能力在產量和纖維品質上均高于受體植株。有研究表明[24]，OsNAC10基因過量表達，顯著提高水稻抗旱耐鹽性，且正常情況下，轉OsNAC10基因使水稻產量增加5%～14%，干旱條件下相對于對照增產25%～42%，該結果與本試驗結果一致。

棉花纖維的長度、強度、馬克隆值等品質是評價棉花品質的重要指標。培育纖維品質較好的棉花品種是當前棉花育種工作重點之一[25]。目前，NAC基因的研究集中在擬南芥[26]、水稻[27]等植物上，在棉花中的研究較少。Zhong[28]研究報道了NAC轉錄因子SND1參與調控擬南芥纖維次生壁合成，在木質部纖維和莖維管束纖維特異表達，SND1過表達或抑制造成纖維次生壁的加厚或缺失。本研究表明，在干旱脅迫后，轉CarNAC1基因棉花在提高其抗旱性的同時，與受體材料相比，增加棉花產量并保持相對較高的纖維品質水平。由此推測，轉CarNAC1基因棉花的纖維品質受干旱脅迫影響較小。有研究表明[29]NAC基因參與調節(jié)棉纖維細胞次生壁的合成。CarNAC1基因是否參與調控棉花纖維細胞的合成有待于進一步研究。

光合作用是植物生長和產量形成的生理基礎[30]，氣孔作為水分和CO2進出葉片的通道，通常在干旱、高溫等逆境脅迫下，葉片氣孔都有不同程度的關閉[31]。研究表明[32]，水稻SNAC1基因在干旱脅迫下，氣孔保衛(wèi)細胞特異表達，促進氣孔關閉，降低水分蒸騰速率，但不影響光合速率，因而植株抗旱性大為提高。本試驗結果顯示，轉CarNAC1基因棉花在受到干旱脅迫后，氣孔導度迅速下降，可能是由于CarNAC1在干旱脅迫下，氣孔保衛(wèi)細胞特異性表達，保持了相對較高的光合能力。通過隸屬函數法對16個棉花品系進行綜合評價，發(fā)現大多數轉CarNAC1棉花品系在干旱脅迫下的綜合抗旱能力均高于非轉基因棉花，并一定程度上提高了植株的生物量和籽棉產量，但少數轉CarNAC1棉花品系在干旱脅迫下的綜合抗旱能力低于非轉基因棉花。該現象可能是由于響應干旱脅迫時，NAC轉錄因子除了被誘導表達外，也可能存在表達受抑制的情況。如Han[33]研究結果表明，番茄SlNAC3基因在鹽、干旱和ABA脅迫處理下其轉錄表達受抑制。

滲透調節(jié)是植物耐受干旱環(huán)境的重要生理機制[34]。丙二醛(MDA)、脯氨酸(PRO)、可溶性糖、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、總超氧化物歧化酶(SOD)都是與旱脅迫密切相關的理化指標。本實驗研究表明，室內培養(yǎng)條件下，在棉花苗期用15%的PEG干旱模擬脅迫后，供試材料的丙二醛含量隨脅迫時間增加均呈現上升趨勢，但轉基因棉花的丙二醛含量顯著低于受體材料K62。轉基因棉花品系的脯氨酸、可溶性糖、過氧化氫酶、過氧化物酶以及總超氧化物歧化酶活力均顯著高于受體材料K62。由以上結果可以推測外源CarNAC1基因可能提高了棉花抗旱性，增強了棉花自我滲透調節(jié)能力。

綜上所述，本文通過室內試驗和田間試驗多方面證明,轉CarNAC1基因提高了棉花抗旱能力，并篩選出綜合抗旱能力較強的品系ZK62-6，將有助于推動干旱區(qū)棉花轉基因育種工作。