NaN3和紫外線復合誘變對苜蓿愈傷組織在干旱和鹽脅迫下生長的影響

李 波，林 浩，鄔婷婷，陳雪梅

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生的豆科類草本植物，具有產量高、營養價值高的特性，被世界公認為優質牧草之一[1]。由于近幾年環境干旱和土地鹽漬化的加劇，導致紫花苜蓿的種植面積逐年減少, 嚴重威脅其產量，因此，亟待加強培育抗逆性強的苜蓿新品種，以豐富我國匱乏的苜蓿種質資源。

植物耐鹽和抗旱機制是錯綜復雜的, 耐鹽和抗旱性狀是受多基因控制的, 涉及多種生理代謝途徑。為了獲得抗逆性強的苜蓿新品種，評價耐鹽和抗旱突變材料生理生化功能上的差別，采用理化誘變因素復合處理的方法開展耐逆紫花苜蓿研究，以期獲得優良農藝性狀的新種質材料，對紫花苜蓿耐鹽和抗旱育種及生理機制研究有一定參考價值，有利于豐富我國苜蓿的品種資源，推動苜蓿產業化發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以圖牧2號苜蓿無菌苗的下胚軸誘導出的愈傷組織為材料，由齊齊哈爾大學植物組織培養研究室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的繼代培養 將淡黃色、松嫩的愈傷組織切割成0.5 cm3左右的小塊，轉接到繼代培養基中，繼代2～3次的愈傷組織即可作為誘變和脅迫的材料。繼代培養基為MS+2,4-D 1 mg·L-1+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ 30 g蔗糖+8.5 g瓊脂(pH=5.8)。

1.2.2 NaN3和紫外線誘變半致死濃度(劑量)選擇 用磷酸緩沖液(pH=7.0，0.2 M)配置濃度為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0×10-3mol·L-1和5.5×10-3mol·L-1的NaN3溶液，將愈傷組織置于NaN3溶液中,低速搖床震蕩4 h后無菌水沖洗3次，愈傷組織轉接在繼代培養基，每個梯度約120塊愈傷組織(每塊約0.5 cm3),25℃恒溫培養箱中培養25 d。

選取30 W的紫外燈管，以20 cm的距離和不同的照射時間(2、3、4、5、6、7 min和8 min)為紫外線的誘變劑量，每個梯度處理約90塊愈傷組織，避光黑暗25℃恒溫培養箱中培養25 d。

1.2.3 NaCl和PEG脅迫致死濃度的篩選 將愈傷組織切割成0.5 cm3左右小塊，接種在含有不同濃度的PEG-6000液體培養基中，PEG脅迫的濃度梯度為0%、15%、20%、25%和30%，每個梯度處理約90塊愈傷組織，25℃恒溫培養箱中培養，分別在2、4、6、8 d和10 d將其轉接到MS固體培養基中培養。

將愈傷組織切割成0.5 cm3左右小塊，轉接至NaCl梯度培養基中(NaCl濃度為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%)，每種鹽濃度處理約90塊愈傷組織，25℃的恒溫培養箱中培養12 d。

1.2.4 復合誘變后愈傷組織的干旱、鹽脅迫 將復合誘變處理后生長良好的愈傷組織轉接在含NaCl和PEG的致死濃度培養基中，分別脅迫處理8 d和10 d，存活的愈傷組織繼代培養。繼代兩次后，將NaCl處理的部分愈傷組織轉入含PEG的致死培養基中，進行脅迫處理10 d，存活的愈傷組織繼代培養。

1.2.5 生理生化指標的測定 游離脯氨酸含量測定采用茚三酮法，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖含量的測定采用蒽酮法，過氧化氫酶活性(CAT)測定采用紫外吸收法。

1.3 愈傷組織存活率和愈傷組織致死率的測定

愈傷組織存活率(%)=愈傷組織存活(塊)數/接種愈傷組織總(塊)數×100%

愈傷組織的致死率(%)=愈傷組織死亡(塊)數/接種愈傷組織總(塊)數×100%

1.4 數據處理與分析

利用統計分析軟件Execl 2003、SPSS 17.0對所測定的各項生理指標的數據進行方差分析，比較各項生理指標變化的差異及顯著性。

2 結果與分析

2.1 NaN3和紫外線誘變對愈傷組織生長的影響

2.1.1 NaN3誘變 苜蓿愈傷組織對NaN3誘變劑比較敏感，經過不同濃度的NaN3誘變后，其生長受到顯著的影響(見圖1)，表現出隨NaN3濃度的增加，愈傷組織受損傷程度加重，其生活力明顯降低，愈傷組織色澤由淡黃色轉變為黃褐色，甚至為褐色。NaN3濃度與愈傷組織存活率間呈負相關性(見表1)，在誘變后培養初期(前5 d)愈傷組織無明顯變化，第10天左右隨著NaN3濃度的增加愈傷組織逐漸褐化死亡。培養至25 d時，隨著NaN3誘變濃度的增加，愈傷組織的致死率增加，4.0×10-3mol·L-1NaN3處理組的致死率為50.83%，此濃度為NaN3的LG50，NaN3濃度為5.5×10-3mol·L-1處理組致死率為95.83%，此濃度為NaN3的LC100，LC50為愈傷組織死亡近一半的NaN3濃度，LC100為愈傷組織近全部死亡的NaN3濃度。

2.1.2 紫外線誘變 苜蓿愈傷組織經過不同劑量紫外線誘變后，其生長狀態受到一定的影響(見圖2)，表現出隨紫外線劑量的增加，愈傷組織存活率逐漸下降。在誘變初期(前5 d)愈傷組織無明顯變化，第10天左右隨著紫外線輻射劑量的增加愈傷組織逐漸褐化死亡(見表2)，隨著培養時間的推移，各誘變處理組死亡率提高。處理時間大于6 min，愈傷組織表現為生活力明顯降低，色澤由淡黃色轉變為黃褐色，甚至成為褐色，存活率大大下降。紫外線輻射與愈傷組織存活率呈負相關，愈傷組織培養至25 d時，隨著紫外線誘變劑量的增加，愈傷組織的致死率逐漸增加，6 min處理組的致死率為51.11%，此劑量為紫外線的LC50，8 min處理組致死率達到96.67%，此劑量為紫外線的LD100。

2.1.3 復合誘變下苜蓿愈傷組織生長狀況 苜蓿愈傷組織經過復合誘變處理后，其生長狀況受到明顯的抑制，愈傷組織存活率降低(見圖3)。復合誘變處理前6 d愈傷組織顏色變淡，沒有生長活力，培養至15 d左右，部分愈傷組織開始緩慢恢復生長(見圖4)，20 d時部分存活下來逐漸生長，當培養至25 d時，愈傷組織顏色逐漸轉為淡綠色，旺盛生長。

注：1～10為NaN3濃度為0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5×10-3 mol·L-1的愈傷組織。Notes：1～10 was callus under NaN3concentration of 0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5×10-3 mol·L-1.圖1 不同濃度NaN3誘變苜蓿愈傷組織Fig1 Alfalfa callus induced by different concentrations of NaN3

表1 NaN3誘變苜蓿愈傷組織生長狀況Table 1 The growth status of alfalfa callus induced by NaN3 mutagenesis

注：1～8為紫外線照射不同時間(0，2，3，4，5，6，7 min和8 min)苜蓿愈傷組織。Notes：1～8 was callus of UV irradiation for different time( 0，2，3，4，5，6，7 min and 8 min).圖2 紫外線輻射苜蓿愈傷組織Fig 2 Alfalfa callus under ultraviolet radiation

表2 紫外線輻射苜蓿愈傷組織生長狀況Table 2 Growth status of alfalfa callus after ultraviolet radiation

圖3 復合誘變愈傷組織的存活率Fig.3 The survival rate of callus by hybrid mutagenesis

圖4 復合誘變苜蓿愈傷組織Fig.4 Alfalfa callus by hybrid mutagenesis

圖5 NaCl脅迫下愈傷組織的存活率Fig.5 The survival rate of callus under NaCl stress

2.2 NaCl和PEG脅迫對愈傷組織存活率和生長狀況的影響

NaCl脅迫下苜蓿愈傷組織存活率的變化見圖5,生長狀況見圖6。隨著鹽濃度的增加和處理時間的增加苜蓿愈傷組織的存活率逐漸降低，在NaCl脅迫處理10 d和濃度為1.0%時、8 d和濃度1.5%時，愈傷組織存活率分別為53.96%、54.31%，均達到NaCl的LC50，在NaCl脅迫處理12 d和濃度為2.0%時，愈傷組織存活率達到最低，為17.45%，褐化率最高，此濃度為NaCl的LC100。

PEG脅迫苜蓿愈傷組織生長狀況見圖7，愈傷組織存活率的變化見圖8。隨著PEG濃度的增加及處理天數的增加苜蓿愈傷組織的存活率逐漸降低，在PEG脅迫6 d和濃度為25%時，存活率為48.10%，此濃度為PEG的LC50，在PEG脅迫10 d和濃度為30%時，其存活率最低，為3.80%，此濃度為PEG的LC100。

2.3 復合誘變對干旱和鹽脅迫下苜蓿愈傷組織存活率的影響

復合誘變和混合高鹽及干旱脅迫下苜蓿愈傷組織生長狀況見圖9，愈傷組織的存活率變化見圖10。經復合誘變的PEG脅迫、復合誘變的NaCl脅迫、復合誘變的PEG和NaCl脅迫處理后的苜蓿愈傷組織，隨著培養時間的增加其存活率下降，直到15～18 d時生長狀態趨于穩定，經復合誘變的PEG和NaCl處理下的愈傷組織存活率最低，為16%。

注：1～5為0，0.5%，1.0%，1.5%和2%濃度NaCl處理的愈傷組織。Note：1～5 was callus under NaCl concentration of 0，0.5%，1.0%，1.5% and 2%.圖6 NaCl脅迫下苜蓿的愈傷組織Fig. 6 Alfalfa callus under NaCl stress

注：1～5為0，15%，20%，25%和30%濃度PEG處理的愈傷組織。Notes：1～5 was callus under PEG concentration of 0，15%，20%，25% and 30%.圖7 PEG脅迫下苜蓿的愈傷組織Fig.7 Alfalfa callus under PEG stress

圖8 PEG脅迫下愈傷組織的存活率Fig.8 Survival rate of callus under PEG stress

注：1.復合誘變(LC50)+PEG(LC100);2.復合誘變(LC50)+NaCl(LC100);3.復合誘變(LC50)+PEG(LC100)+NaCl(LC100)。Notes：1. hybrid induced(LC50)+PEG(LC100);2. hybrid induced (LC50)+NaCl(LC100);3. hybrid induced (LC50)+PEG(LC100)+NaCl(LC100).圖9 復合誘變及鹽和干旱脅迫下苜蓿愈傷組織Fig.9 Alfalfa callus under hybrid mutagenesis and stress of salt and drought

圖10 復合誘變及鹽和干旱脅迫下愈傷組織的存活率Fig.10 Survival rate of callus under hybrid mutagenesis and stress of salt and drought

2.4 誘變和脅迫處理苜蓿愈傷組織的生理變化

經脅迫和誘變苜蓿愈傷組織的脯氨酸、可溶性糖、丙二醛的含量及CAT酶活性的變化見表3，脅迫和誘變處理與對照比較提高了脯氨酸、可溶性糖和CAT酶活性，降低了丙二醛的含量。NaCl和PEG脅迫脯氨酸比對照增加了55.36%和41.88%，可溶性糖比對照增加了52.15%和37.12%，CAT酶活性比對照增加了7.58%和5.77%，丙二醛含量比對照降低了30.66%和25.23%。在三種誘變處理中，NaN3誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對照增加了59.77%、77.91%和9.61%,丙二醛含量比對照降低了40.48%；紫外線誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對照增加66.75%、105.83%和9.72%,丙二醛含量比對照降低了44.56%；NaN3+紫外線混合誘變后的脯氨酸、可溶性糖含量和CAT酶活性分別比對照增加155.31%、258.90%和21.14%，丙二醛含量比對照降低了64.20%。三種誘變方式中，混合誘變愈傷組織脯氨酸、可溶性糖及CAT酶活性均最高，丙二醛含量最低。在混合誘變中，NaCl、PEG和NaCl+PEG混合脅迫比較，NaCl+PEG混合脅迫愈傷組織脯氨酸、可溶性糖及CAT酶活性均最高，丙二醛含量最低，NaN3+紫外線混合誘變處理提高了苜蓿愈傷組織對鹽和干旱的抵抗能力。

表3 誘變及干旱和鹽脅迫下苜蓿愈傷組織的生理和生化指標的變化Table 3 Changes of physiological and biochemical indexes under mutagenesis and stress

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Note：Different letters indicate significant difference (P<0.05), and the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

3 討 論

3.1 復合誘變效應

單一因素雖能引起某些植物性狀的突變，但誘變效果還不夠理想，誘變譜也比較單純，為了提高誘變育種效果，理化因素復合誘變處理受到廣泛關注。由于射線改變了生物膜的完整性和滲透性，從而有助于化學誘變劑的吸收[4-6]。物理和化學因素的復合處理，可以產生累加效應，提高突變頻率和誘變效果。多數試驗證實了復合處理增加誘變效應的可能性。付鳳玲等[8]用射線輻射和NaN3處理玉米愈傷組織，在含1.0% NaCl的高滲培養基上篩選，對再生植株株系進行耐鹽性鑒定。結果表明，20 Gy的輻射和1 mmol·L-1NaN3是較為適合玉米愈傷組織誘變的處理組配，22個再生植株株系中有5個誘變株系的耐鹽性高于未誘變對照。鹿巍[9]采用紫外線及化學誘變EMS的方法對小麥葉銹菌菌株05-5-46的單胞菌系進行誘變，得到的4株小麥葉銹菌突變菌株為新的致病類型。本研究發現不同的誘變處理方法，可以影響苜蓿愈傷組織的存活率，且在一定的NaN3和紫外線誘變下，存活的愈傷組織增加其對NaCl和PEG的抵抗能力，說明紫外線和NaN3復合誘變可提高苜蓿愈傷組織的誘變效應。

3.2 復合誘變對苜蓿愈傷組織生理和生化水平的影響

從脯氨酸、可溶性糖含量和CAT活性的變化來看，這三項指標變化情況一致，經復合誘變處理后，三項指標均有大幅度增加，說明理化復合誘變可以增強某些生理生化指標的含量，來提高機體的抵抗能力[10-11]。單一化學誘變處理或物理誘變使三項指標的含量均小幅上升，而丙二醛的含量經復合誘變處理含量的下降趨勢也要高于單因素誘變，這說明理化復合誘變對苜蓿愈傷組織的影響較大，這可能與理化復合誘變的特性有關。

為了適應誘變后鹽和干旱脅迫，植物體內存在的抗氧化酶系統包括過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等可以緩解因逆境帶來的傷害[12]。CAT酶是生物體內的主要抗氧化酶，它能促進細胞中過氧化氫的分解，減輕過氧化氫對細胞的損害，試驗發現苜蓿愈傷組織經誘變脅迫處理后，特別是復合誘變+NaCl+PEG處理苜蓿愈傷組織CAT活性大大提高。

復合誘變+PEG+NaCl處理均高于紫外線+NaCl+PEG和NaN3+NaCl+PEG處理，表明復合誘變苜蓿愈傷組織的抗性比單一因素誘變愈傷組織的抗性強。理化復合誘變處理對苜蓿愈傷組織的影響較為復雜，但總體表現出理化復合誘變+PEG+NaCl處理對誘變起著主導性的作用，這說明理化復合誘變處理的誘變效果強于單因素誘變，能提高苜蓿愈傷組織的抗逆性，這可能與復合誘變處理的多方向性和不定向性有關。