ADAM-17抑制劑TNF484對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

張東升，周方正，陳 潔，郭思言，聶 龍，李艷梅

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一種常見惡性腫瘤，其惡性程度高，臨床診斷往往都已較晚，嚴重威脅著人類的健康，抑制和控制腫瘤的轉移是治療和預防癌癥的主要策略[1,2]。腫瘤的侵襲和轉移是多基因、多步驟相互作用的過程。目前有研究認為細胞外基質降解酶系統：基質金屬蛋白酶家族和去整合素-金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteases，ADAMs)參與了腫瘤侵襲及轉移過程。

ADAM-17被稱為α腫瘤壞死因子轉換酶(tumor necrosis factor-alpha converting enzyme, TACE)，ADAM-17可以剪切脫落雙調蛋白、轉化生長因子等多種表皮生長因子受體的配體，直接間接激活表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)相關通路來影響腫瘤細胞的發生、發展及轉移[3]。許多研究表明，ADAM-17在許多腫瘤中過表達，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移過程，提示該基因可能在腫瘤進展中起重要作用，ADAM-17和其他ADAM蛋白酶可能是治療癌癥和其他疾病的潛在靶標[4]。由于其許多家族成員的結構復雜，且在不同的腫瘤中表達不同，對ADAM-17抑制劑的研究尚在早期階段，因此ADAM-17對腫瘤的抑制作用需要進一步研究，這可能使ADAM-17成為新的潛在臨床治療靶點。本研究旨在探討ADAM-17抑制劑TNF484對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及抑制劑 將人肝癌HepG2細胞株和Bel7402細胞在DMEM培養液(GIBCO，USA)中培養，10%胎牛血清(GIBCO，USA)，在37 ℃，5%CO2和75%濕度的培養箱中，培養液每3 d更換一次。

1.2 細胞活力檢測 將1×104HepG2和Bel7402細胞懸浮在96孔板中的每個孔中，加入不同濃度的抑制劑，在37 ℃培養箱中孵育72 h，正常細胞為陰性對照。孵育后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續培養4 h。將96孔板在4 ℃下以1200 g離心10 min，小心吸出上清液，然后將每孔加入50 μl二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min。在酶聯免疫檢測儀490 nm吸光度下測量各孔的吸光值(OD)。測定細胞增殖及細胞活性。計算公式：抑制率IR=1-試驗組的平均OD值/對照組的平均OD值。

1.3 qRT-PCR檢測ADAM-17mRNA的表達 各組細胞于6孔板培養72 h后，將不同濃度(0～1 μM)的TNF484(ADAM-17抑制劑，Sigma公司)加入各組細胞培養。按Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，以GAPDH作為內參基因。RT-PCR反應條件：95 ℃, 5 min預變性后，94 ℃，20 s，退火溫度60 ℃, 20 s，共40個循環，延伸溫度72 ℃ 40 s。終止反應。

1.4 遷移分析 使用xCELLigence系統(羅氏公司)檢測HCC細胞的遷移能力。在CIM-16孔反應板的下室加入200 μl(2×104)細胞懸液，陽性組加入TNF484，不加TNF484作為陰性對照組。然后將10%含血清的DMEM培養液加入下室。xCELLigence系統對生長于反應孔板上的細胞阻抗進行記錄。 經過72 h在RTCA分析儀上進行細胞遷移分析。

1.5 細胞侵襲實驗 使用三維共培養模型(Trevigen公司)測定肝癌細胞在TNF484抑制下的侵襲能力。成球和侵襲基質成分的準備按照說明書的要求做。用DMEM和成球基質混合細胞，在3D球培養板的每個孔中加入5×102個細胞，在4 ℃條件下，200 g離心3 min。將培養板放入37 ℃孵育72 h，讓球體形成。在加入侵襲基質之前，在4 ℃條件下，300 g離心5 min。然后將培養板放入37 ℃，孵育1 h，促進侵襲膠的形成。在孔中加入10 μM的TNF484, 每24 h記錄成球的圖像。用GraphPad Prism軟件對圖像進行分析。

2 結 果

2.1 TNF484抑制劑對肝癌細胞增殖能力的影響 隨著抑制劑濃度增加，抑制率也增高，TNF484在100 μM 時對HepG2和BEL7402細胞增殖抑制作用最大(表1)。

細胞株(μmol/L)HepG2BEL-740205.8±0.94.2±0.5118.1±1.917.9±1.81060.2±2.865.3±2.55075.2±3.173.1±3.310080.0±5.685.0±5.8

注：不同濃度之間抑制率比較，P<0.05

2.2 TNF484抑制劑對肝癌細胞遷移能力的影響 TNF484孵育細胞72 h，10 μM濃度條件下，即可顯著抑制細胞的遷移，HepG2細胞的空白對照組及抑制組的細胞分數分別為80.92%±6.10%、55.60%±4.21%，BEL7402細胞的空白對照組及抑制組的細胞分數分別為82.62%±6.15%、59.8%±4.27%，兩組之間細胞分數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.3 TNF484抑制劑對肝癌細胞系中ADAM-17表達水平的影響 10 μM TNF484在處理72 h后HepG2及BEL-7402細胞株中ADAM17 RNA表達水平降低，抑制率分別為(45.0±3.1)%及(48.0±3.3)%，與處理前比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.4 TNF484抑制劑對肝癌細胞侵襲能力的影響 與空白組相比，10 μM的TNF484顯著降低了HepG2及BEL-7402細胞的侵襲能力(圖1)，陽性對照組第1天細胞的遷移能力分別為空白對照組的(35.7±3.1)%、(39.7±3.5)%，第15天細胞的遷移能力分別為空白組的(30.7±2.1)%、(31.2±2.6)%(P<0.05)。

圖1 TNF484抑制劑對肝癌細胞株侵襲能力的影響A.HepG2; B. BEL-7402

3 討 論

腫瘤的侵襲及轉移是多基因、多步驟相互作用的過程，主要包括惡性腫瘤細胞從原發灶遷移黏附到細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、降解并穿過ECM和基膜、通過血管進入宿主微環境等步驟。肝癌廣泛轉移是其造成高病死率的主要原因，因此找到一種能夠抑制肝癌侵襲轉移的藥物，是有效治療肝癌的關鍵。

目前的研究認為，ADAM-17在腫瘤的轉移和侵襲中起重要作用[5]。ADAM-l7是ADAMs 家族成員之一，屬于含鋅蛋白酶，具有水解細胞膜上的腫瘤壞死因子的功能[6]。與大多數的ADAMs成員類似，ADAM-17具有多個功能結構域[7]，在N端，存在保守的氨基酸序列，稱之為半胱氨酸開關，與催化區的Zn2+結合，使ADAM-17處于酶原狀態。ADAM-17可以剪切脫落雙調蛋白、轉化生長因子等多種表皮生長因子受體的配體，直接或間接激活EGFR相關通道。通過激活PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK等多條信號轉導途徑影響腫瘤細胞基因表達、細胞的增殖分化和侵襲[8,9]。近年來多項研究表明，ADAM-17 在非小細胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結直腸癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中高表達，并促進腫瘤的侵襲轉移過程[10-12]，ADAM-17可能成為肝癌特異性治療的潛在靶點。

目前EGFR、VEGF等靶向治療藥物已取得滿意的臨床療效，ADAM-17 抑制藥的研究還在起步階段，需進一步明確其抑制腫瘤作用[3,13]。TNF484是以琥珀酸為基礎的氧肟酸，有很強的TACE抑制性[4]。當前TNF484在肝癌細胞株中的研究較少，本研究發現TNF484對肝癌細胞株增殖能力有明顯的抑制作用且呈劑量依賴性，且在遷移和侵襲也有著顯著的抑制作用。本實驗中，TNF484在10 μM濃度條件下，HepG2和BEL7402細胞株的空白對照組及陽性組即有顯著的統計學意義，同時也發現TNF484可以顯著降低癌細胞中ADAM-17的表達，與文獻[14]報道一致。因此，推論TNF484可能通過降低ADAM-17在HCC中的表達來抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移，進而抑制HCC的發展。TNF484對肝癌動物模型中腫瘤的生長和侵襲的抑制作用，需要進一步檢測。

總之，ADAM-17抑制劑TNF484抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。