中藥單體白花丹醌通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路抑制結(jié)腸癌血管生成的實驗研究

李奕璇

0 引言

結(jié)腸癌好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，具有浸潤能力強(qiáng)、惡性程度高的特點[1]。結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，容易漏診，一旦確診，癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的身體健康和生命安全。研究表明，腫瘤血管的生成在腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[2]，因此，采取有效的措施抑制腫瘤血管生成可以有效抑制癌細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。白花丹醌(Plumbagin)是從百花丹(Phum bago zeylanicaL.)中提取出來的生物活性物質(zhì)，對多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用[3]。有研究表明，白花丹醌能夠通過抑制腫瘤血管的生成抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[4]，然而白花丹醌對結(jié)腸癌血管生成的影響尚未見報道。貝伐單抗能夠與血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)結(jié)合并阻斷其活性，進(jìn)而抑制新血管生成[5]。本研究以貝伐單抗為陽性藥物，探究中藥單體白花丹醌對結(jié)腸癌血管生成和VEGF/VEGFR2信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細(xì)胞株 健康雄性BALB/c裸鼠70只，SPF級，4～5周齡，體重15～20 g，購自北京實驗動物研究中心，許可證號：SYXK(京)2015-0046。結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.2 主要材料與儀器 白花丹醌(美國Sigma公司)；貝伐單抗(批號：S20100023)購自瑞士羅氏公司；TRIzol reagent購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物(大連)有限公司；TaqDNA聚合酶購自英國NEB公司；兔抗鼠VEGF、VEGFR2多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；3K15超低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司；超凈臺購自上海蘇凈實業(yè)有限公司；引物序列由深圳華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿瓶底85%左右時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凍存。

1.2.2 裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型制備 隨機(jī)選取10只裸鼠為假手術(shù)組，其余裸鼠按照文獻(xiàn)資料[6]建立結(jié)腸癌移植瘤模型，將人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106/ml，用75%的酒精將裸鼠右前肢腋下消毒，用微量注射器將細(xì)胞懸浮液緩慢注射進(jìn)裸鼠右前肢腋下，200 μl/只，假手術(shù)組注射等量容積的生理鹽水，以造模后第3天可肉眼觀察到米粒樣移植瘤作為模型構(gòu)建成功的標(biāo)志。

1.2.3 動物分組 入選50只造模成功的裸鼠，隨機(jī)分成5組：模型組、貝伐單抗組、白花丹醌低劑量組、白花丹醌中劑量組、白花丹醌高劑量組，每組10只。貝伐單抗組：腹腔注射5 mg/kg貝伐單抗；白花丹醌低劑量組：腹腔注射2 mg/kg白花丹醌；白花丹醌中劑量組：腹腔注射4 mg/kg白花丹醌；白花丹醌高劑量組：腹腔注射6 mg/kg白花丹醌；假手術(shù)組及模型組給予等量容積生理鹽水，持續(xù)治療4周。

1.2.4 六組裸鼠移植瘤體積的比較 持續(xù)治療4周后，將各組裸鼠脫頸椎處死，在無菌條件下分離出完整瘤組織，用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑(a)與短徑(b)，計算得出腫瘤體積，V=1/2ab2。

1.2.5 免疫組化染色檢測移植瘤微血管密度(MVD) 選取與正常組織交界處的腫瘤組織(假手術(shù)組選取造模時注射部位的組織)制作石蠟切片(切片厚度小于5 μm)，二甲苯脫蠟后進(jìn)行梯度脫水，用PBS溶液洗滌2～3次，將組織切片在92～98 ℃條件下存放20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清中和非特異性反應(yīng)后，在組織玻片上滴加稀釋的兔抗鼠CD43多克隆抗體，于4 ℃過夜放置，用PBS溶液洗滌2～3次，復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記的二抗，于避光條件下室溫孵育20 min，用甘油封片后，于顯微鏡下觀察6組裸鼠移植瘤中微血管的密度。判斷標(biāo)準(zhǔn)：染色后呈棕色或者褐色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均可記為1個血管，以200倍視野下平均微血管數(shù)記為MVD。

1.2.6 qRT-PCR檢測移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 取6組裸鼠移植瘤組織，用TRIzol reagent提取其總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)VEGF、VEGFR2的cDNA序列設(shè)計引物，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。PCR的反應(yīng)體系為：5×緩沖液 10 μl，TaqDNA聚合酶 1 μl，上游引物F 2 μl，下游引物R 2 μl，10 mmol dNTP mix 1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 33 μl；PCR的反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95 ℃ 5 min，變性：95 ℃ 30 s，延伸：62 ℃ 15 s，40個循環(huán)。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法(2-△△Ct)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，計算VEGF、VEGFR2 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.2.7 Western blot檢測移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平 取6組裸鼠移植瘤組織，加入2 ml細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣體積20 μl，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50 min，分別滴加兔抗鼠VEGF、VEGFR2多克隆抗體，置于4 ℃下過夜，滴加二抗后37 ℃放置1 h。加入發(fā)光劑顯影，利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并利用Gel-Pro analyzer4 軟件對SDS-PAGE電泳圖目的條帶進(jìn)行掃描，分析VEGF、VEGFR2表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠結(jié)腸癌移植瘤模型的鑒定 造模后第3天，模型組裸鼠的右前肢腋下可見米粒樣移植瘤，假手術(shù)組未見明顯異常，提示移植瘤模型構(gòu)建成功。

2.2 六組裸鼠移植瘤體積比較 假手術(shù)組裸鼠右前肢腋下沒有移植瘤形成，模型組移植瘤體積最大[( 2 012.58±406.32) mm3]；貝伐單抗組移植瘤體積顯著小于模型組(P<0.05)；白花丹醌高劑量組移植瘤體積與貝伐單抗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；白花丹醌高劑量組移植瘤體積顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05)，且隨白花丹醌劑量增加，移植瘤體積顯著減小，呈劑量依賴性。見表1。

表1 六組裸鼠移植瘤體積比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與貝伐單抗組比較，&P<0.05；與白花丹醌低劑量組比較，△P<0.05；與白花丹醌中劑量組比較，▲P<0.05

2.3 免疫組化染色檢測移植瘤MVD 模型組移植瘤MVD顯著大于假手術(shù)組(P<0.05)；貝伐單抗組移植瘤MVD顯著小于模型組(P<0.05)；白花丹醌高劑量組移植瘤MVD與貝伐單抗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，白花丹醌高劑量組移植瘤MVD顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05)，且隨白花丹醌劑量增加，移植瘤MVD顯著減小，呈劑量依賴性。見表2。

表2 六組裸鼠移植瘤MVD比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與貝伐單抗組比較，&P<0.05；與白花丹醌低劑量組比較，△P<0.05；與白花丹醌中劑量組比較，▲P<0.05

2.4 qRT-PCR檢測移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 模型組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；貝伐單抗組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)；白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA與貝伐單抗組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05)，且隨著白花丹醌劑量增加，移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的表達(dá)水平顯著下降，呈劑量依賴性。見表3。

表3 移植瘤中VEGF、VEGFR2 mRNA的相對表達(dá)水平

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與貝伐單抗組比較，&P<0.05；與白花丹醌低劑量組比較，△P<0.05；與白花丹醌中劑量組比較，▲P<0.05

2.5 Western blot檢測6組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平 模型組移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)；貝伐單抗組移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05)；白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2與貝伐單抗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，白花丹醌高劑量組移植瘤中VEGF、VEGFR2顯著小于白花丹醌低、中劑量組(P<0.05)，且隨白花丹醌劑量增加，移植瘤中VEGF、VEGFR2的表達(dá)水平顯著下降，呈劑量依賴性。見圖1、表4。

圖1 Western blot檢測六組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平

注：A.假手術(shù)組，B.模型組，C.貝伐單抗組，D.白花丹醌低劑量

組，E.白花丹醌中劑量組，F(xiàn).白花丹醌高劑量組

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與貝伐單抗組比較，&P<0.05；與白花丹醌低劑量組比較，△P<0.05；與白花丹醌中劑量組比較，▲P<0.05

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球每年的結(jié)腸癌新增病例約為100萬，其中我國約占全球的20%[7]。目前結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)治療和放、化療[8-10]，手術(shù)治療對于早期結(jié)腸癌患者具有顯著療效，但對于已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的中晚期結(jié)腸癌患者具有一定的局限性。放、化療具有很大的毒副作用，而且其不能從根本上解決癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移的問題。研究表明，腫瘤血管的生成與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]，因此，采取有效的藥物抑制腫瘤血管的生成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為結(jié)腸癌中醫(yī)屬于“腸覃”、“積聚”、“鎖肛痔”的范疇，其發(fā)病原因主要包括腎虛、脾虛、濕熱、瘀滯等[11]。白花丹醌是從植物中提取的天然活性物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化的作用[12]。謝金玲等[13]研究表明，白花丹醌能夠體外抑制人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖和侵襲，并通過調(diào)控HepG2細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)水平促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。徐凱紅等[14]研究表明，白花丹醌能夠抑制白血病荷瘤小鼠移植瘤的生長，并能夠促進(jìn)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡。Kawiak等[15]研究表明，白花丹醌能夠體外抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR3和BT474的增殖，并通過調(diào)控SKBR3和BT474細(xì)胞中Bax和Bcl-2的表達(dá)水平促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Yan等[16]研究表明，白花丹醌能夠抑制乳腺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長，抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231SArfp在骨微環(huán)境中的生長，促進(jìn)移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡。賴力等[4]研究表明，白花丹醌能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和遷移，并能夠抑制腫瘤血管生成，這一結(jié)果在前列腺癌裸鼠移植瘤實驗中得到證實。然而，白花丹醌對結(jié)腸癌血管生成的影響尚未見報道。本研究探究中藥單體白花丹醌對結(jié)腸癌血管生成和VEGF/VEGFR2信號通路的影響。貝伐單抗能夠與VEGF結(jié)合并阻斷其活性，進(jìn)而抑制新血管生成[5]，因此，本研究以貝伐單抗為陽性藥物，結(jié)果表明，白花丹醌能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長和腫瘤微血管生成，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

白花丹醌能夠抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤生長和腫瘤微血管生成，但其作用機(jī)制尚未完全明確。VEGF和VEGFR2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中大量表達(dá)，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)新血管的生成[17]。王偉等[18]研究表明，VEGF/VEGFR2信號通路在腫瘤新血管的生成中發(fā)揮著重要作用，因此，VEGF和VEGFR2可以作為抑制腫瘤血管生成的靶位點。覃雪峰等[19]報道，藥物靶向作用于VEGF/VEGFR2信號通路，進(jìn)而抑制裸鼠肝癌移植瘤新血管的生成，降低移植瘤組織微血管密度。余仔軍等[20]研究顯示，VEGF/VEGFR2信號通路在胃癌的治療中也發(fā)揮著重要的作用。章婷婷等[21]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF/VEGFR2信號通路與膠質(zhì)瘤新血管的生成密切相關(guān)，在膠質(zhì)瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。然而，白花丹醌對VEGF/VEGFR2信號通路的影響尚未見報道。本研究表明，白花丹醌能夠抑裸鼠結(jié)腸癌移植瘤中VEGF和VEGFR2的表達(dá)水平，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

綜上所述，中藥單體白花丹醌能夠抑制結(jié)腸癌移植瘤裸鼠血管生成，推測這一作用是通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路活性來實現(xiàn)的，為結(jié)腸癌的臨床治療提供一定理論基礎(chǔ)。