缺血預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的抑制作用

趙德福 寧顯忠

(錦州醫科大學附屬第三醫院神經內科，遼寧 錦州 121000)

目前，針對腦梗死最有效的治療方法就是血管再灌通〔1〕，即缺血再灌注(IR)，但是IR在某種程度上使腦組織損傷進一步加重，即腦IR損傷〔2，3〕。IR損傷涉及多種病理過程，其中細胞外基質的破壞扮演重要角色。基質金屬蛋白酶(MMP)-9是參與細胞外基質破壞的重要成員〔4〕，其上游調控基因為核因子(NF)-κB。有文獻表明缺血預處理對腦損傷具有一定的保護功能〔5〕。但其對腦IR過程中細胞外基質的破壞是否有抑制作用尚不明確。本實驗探討缺血預處理在腦IR后的細胞外基質破壞過程中是否發揮保護所用。

1 資料與方法

1.1一般資料 病理圖像分析儀(德國萊卡公司); 病理組織切片機(美國AO820)；電子天平(北京賽多利公司)；光學顯微照相系統(日本佳能公司)。二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(北京博奧森生物技術公司);NF-κB一抗、MMP-9一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。由遼寧醫學院實驗動物中心提供的健康SD大鼠60只，雄性，體重230～270 g，許可證號：SCXK(遼)2003-2007。

1.2動物分組及模型制備 大鼠隨機分為假手術(SH)組、IR組及缺血預處理+IR(IP)組。模型制備參考Longa等〔6〕的方法。所有大鼠術前6 h禁水，予濃度為3 ml/kg的水合氯醛腹腔注射，固定于手術臺，于頸中略偏左尋找頸總動脈(CCA)、頸內動脈(ICA)和頸外動脈(ECA)并仔細分離動脈。用手術線結扎CCA和ECA的近心端，于大鼠左側的CCA切一小口，直徑約0.2 mm，將已處理的魚線插入，插入深度為18 mm，以充分阻斷大腦中動脈(MCA)的血流供應，血流中斷15 min后將魚線深度后撤，使MCA血流再灌注，此為缺血預處理。以上操作相同，若大鼠MCA血流中斷時間為2 h，2 h后撤魚線再灌注12 h，此為IR模型。缺血預處理48 h后，制作IR模型。操作步驟與預處理模型及IR制作步驟相同，為缺血預處理+IR模型。假手術組方法為缺血預處理基礎上魚線插入時，其深度不足10 mm，不至于阻斷MCA。所有大鼠于IR 12 h后取腦。

1.3免疫組化法觀察NF-κB、MMP-9的表達 每組取大鼠10只，用濃度為5 ml/kg的烏拉坦腹腔注射，充分麻醉后斷頭，分離出實驗所需海馬組織，以濃度為4%的多聚甲醛固定，制備切片(約5 μm)，脫蠟，洗滌，3%H2O2處理，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L)洗滌3次×5 min，滴加一抗(NF-κB兔抗大鼠多克隆抗體或環氧化酶(COX)-2兔抗大鼠多克隆抗體)，4℃孵育過夜，PBS洗滌5 min×3次，滴加二抗，37℃溫度下孵育時間為30 min，室溫10 min，PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，應用蘇木素復染細胞核，酒精梯度脫水，二甲苯分別透明10 min，封片干燥，顯微鏡下鏡下觀察切片。大鼠海馬CA1區神經細胞規則，排列整齊，選擇其為觀察區域。正常情況下，MMP-9和NF-κB主要存在于胞質，表達量少，被激活后NF-κB從胞質轉移至胞核。

1.4Western印跡檢測NF-κB、MMP-9蛋白的表達 標本取材為剩余10只大鼠，麻醉，同樣取海馬組織，海馬組織剪碎，加入裂解液，離心分裝，取上清液，制備蛋白樣品；蛋白雜色法測定蛋白含量；10%十二烷基苯硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；緩沖液封閉雜交；電化學發光(ECL)試劑盒顯色；分析NF-κB和cox-2蛋白表達量。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件進行單因素方差分析，t檢驗。

2 結 果

2.1神經功能學評分 SH組神經功能無障礙；IR組與SH組(0分)比較，神經功能障礙明顯，評分〔(2.9±0.3)分〕明顯增加(P<0.01)；IP組與IR組比較，神經功能障礙減輕，評分〔(2.1±0.3)分〕明顯降低(P<0.01)。

2.2免疫組化染色結果 SH組細胞內極少有NF-κB、MMP-9的表達。與SH組比較，IR組神經細胞核內NF-κB及細胞質內MMP-9的表達明顯增多(P<0.01)。IP組細胞核內NF-κB及胞質內MMP-9的表達較IR組明顯減少(P<0.01)。見圖1。

圖1 NF-κB、MMP-9免疫組化染色結果(×400)

2.3Western印跡法檢測結果 SH組海馬區幾乎無NF-κB和MMP-9蛋白表達。IR組NF-κB和MMP-9蛋白表達較SH組明顯升高(P<0.01)。IP組NF-κB和MPP-9表達較IR組明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組NF-κB和MMP-9蛋白表達量

與SH組比較：1)P<0.01；與IR組比較：2)P<0.01

3 討 論

腦IR損傷是缺血性腦血管病的一個重要病理過程〔7〕。目前認為參與IR損傷的機制有很多，例如細胞凋亡、炎癥反應〔8〕、細胞外基質破壞等。其中細胞外基質的破壞在腦IR損傷的過程中起到了重要作用。MMP-9是能夠降解細胞外基質的重要物質之一，正常腦組織細胞基本無MMP-9表達，當受到各種不良刺激時，神經細胞就可分泌大量MMP-9〔9，10〕，細胞基底膜被降解，導致腦損傷。NF-κB是MMP-9的上游調控基因，能調控MMP-9的表達。正常情況下NF-κB存在于胞質中，不具有調節轉錄功能〔11〕。在腦組織受損如缺血時，NF-κB被激活并轉入胞核內，迅速啟動相應靶基因轉錄，參與炎癥反應、自由基損傷等病理生理過程〔12〕，加重腦組織IR損傷。

目前臨床上針對IR損傷的各種外源性治療方法效果均不夠理想，缺血預處理是指通過某種方式給予短暫的缺血處理后恢復血流再灌注，以誘導機體產生一種自我保護機制，這種機制可以使機體在短時間內再次受到缺血缺氧損害時，使損害在一定程度上有所降低〔13〕。本實驗表明，NF-κB及MMP-9在大鼠腦IR后病理過程中發揮了重要作用，并且缺血預處理可以抑制NF-κB及MMP-9在IR后表達，從而發揮其腦保護作用。