回陽生肌膏聯合重組人表皮生長因子治療激素與免疫抑制劑致大鼠皮膚潰瘍的效果及機制

孫 超 鄒 婕

(武漢市皮膚病防治院，湖北 武漢 430000)

糖尿病(DM)誘發的皮膚潰瘍是臨床一大疑難癥，癥狀頑固，遷延不愈，反復發作。DM誘發的皮膚潰瘍病機與患者激素水平及免疫系統異常有關〔1〕。中醫將這類由DM誘發的皮膚潰瘍歸屬為“瘡瘍”，《靈樞·癰疽》中提到：寒邪客于經絡之中則血泣，血泣則不通，不通則衛氣歸之，不得復反，故癰腫。寒氣化為熱，熱勝則腐肉，肉腐則為膿。即本病難愈與“腐”有關，因而治療需要以去“腐”生肌為主〔2〕。回陽生肌膏是中醫常用的慢性皮膚潰瘍治療藥方之一，藥方由肉桂、炮姜、黃芪、人參等多味溫陽益氣，活血生肌藥物組成，具有較高臨床效果。本研究旨在探究回陽生肌膏聯合重組人表皮生長因子治療激素與免疫抑制劑致大鼠皮膚潰瘍的實驗效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取SPF級成年雄性SD大鼠72只，平均體重(200±20)g，均購自重慶騰鑫生物技術有限公司，均自由進食進水，喂養于22～25℃，光照12 h，相對濕度45%～60%的環境中。

1.2實驗儀器與藥品 回陽生肌膏由廣州醫科大學附屬中醫院制劑中心提供；ATCC25923金黃色葡萄球菌由廣州醫科大學附屬中醫院免疫研究生提供；氫化可的松、水合氯醛、檸檬酸、鏈脲佐菌素(STZ)由天津金耀氛基酸有限公司提供。羅氏卓越纖巧型血糖儀及配套試紙購自羅氏診斷產品有限公司；DH4000AB型電熱恒溫培養箱由天津市泰斯特儀器有限公司生產；光學顯微鏡由日本OLYMPUS公司生產。

1.3造模方法 采用隨機數字表法分為正常組、模型組、實驗組A和實驗組B各18只。模型組、實驗組A和實驗組B進行造模，操作如下：將50 mg/kg STZ注入0.1 mol/L檸檬酸，制成STZ溶液，造模大鼠每只注入10 ml STZ溶液，隨后每天注射10 ml STZ，常規喂養，3 d后視為大鼠DM造模成功。給予大鼠水合氯醛麻醉，剃除背部毛發，剪皮至筋膜，將20 mm直徑消毒塑膠環埋入切口邊緣，縫合，包扎。

1.4實驗方法 在造模成功后，實驗組A給予回陽生肌膏紗條覆蓋創面，實驗組B采用含有回陽生肌膏和重組人表皮生長因子凝膠的紗條覆蓋創面，正常組和模型組均只給予含有凡士林的紗條覆蓋創面，每天換藥1次，給藥15 d。

1.5觀察指標及檢測方法 觀察各組大鼠用藥前、用藥第4、7、14天的潰瘍面面積及第14天時創面愈合率=(給藥前創面面積-未愈合創面面積)/給藥前創面面積×100%，對比治療第3、10天血清轉化生長因子(TGF)-β、白細胞介素(IL)-6；肉芽組織中血管內皮生長因子(VEGF)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6水平。血清TGF-β、IL-6采用放射免疫法檢測，試劑選用北京福瑞生物工程公司提供的相關試劑盒，操作嚴格按照相關說明書進行。肉芽組織VEGF、eNOS、IL-6檢測選用免疫組織化學方法：常規包埋、切片、脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，選用3%H2O2溶液溫室孵化15 min，洗滌，將切片送入乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中修復10 min，滴入VEGF、TGF、eNOS、IL-6一抗，冷藏，二抗，顯色，復染，封片，檢測。

1.6統計學方法 采用SAS10.0統計軟件進行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組創面愈合比較 用藥前，各組潰瘍創面面積差異無統計學意義(P>0.05)；用藥第3、7、14天，實驗組A、B潰瘍創面面積均顯著小于模型組(P<0.05)，實驗組B潰瘍創面面積均顯著小于實驗組A(P<0.05)；用藥第14天潰瘍愈合率比較，實驗組B>實驗組A>模型組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

用藥14 d圖1 各組用藥3、7、14 d創面愈合情況

組別潰瘍面積(cm2)用藥前用藥3 d用藥7 d用藥14 d第14天潰瘍愈合率(%)正常組-----模型組4.70±0.693.66±0.572.50±0.361.19±0.4474.68±3.57實驗組A4.62±0.803.12±0.431)1.51±0.321)0.58±0.301)87.45±3.291)實驗組B4.68±0.792.69±0.471)2)1.03±0.291)2)0.16±0.091)2)96.58±2.041)2)

與模型組比較：1)P<0.05；與實驗組A比較：2)P<0.05

2.2各組血清TGF-β、IL-6比較 用藥第3、10天，模型組血清TGF-β與正常組差異無統計學意義(P>0.05)，模型組血清IL-6顯著高于正常組(P<0.05)；用藥第3、10天，實驗組A、B血清TGF-β顯著高于模型組(P<0.05)，血清IL-6顯著低于模型組(P<0.05)；用藥第3、10天，實驗組B血清TGF-β顯著高于實驗組A(P<0.05)，血清IL-6顯著低于實驗組A(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清TGF-β、IL-6比較

與模型組比較：1)P<0.05；與實驗組A比較：2)P<0.05；與正常組比較：3)P<0.05；表3同

2.3各組肉芽組織中VEGF、eNOS、IL-6表達水平比較 用藥第3、10天，模型組肉芽組織中eNOS表達水平顯著低于正常組(P<0.05)，VEGF、IL-6表達水平顯著高于正常組(P<0.05)；用藥第3、10天，實驗組A、B肉芽組織中eNOS、VEGF表達水平顯著高于模型組(P<0.05)，IL-6顯著低于模型組(P<0.05)；用藥第3、10天，實驗組B肉芽組織eNOS、VEGF表達水平顯著高于實驗組A(P<0.05)，IL-6顯著低于實驗組A(P<0.05)。見表3。

表3 各組肉芽組織中VEGF、eNOS、IL-6表達水平比較

3 討 論

DM誘發的皮膚潰瘍其病變區域皮膚組織在完整性和連續性損傷之前，就出現組織學及細胞生物學病變，故臨床認為本類皮膚潰瘍屬于內源性〔3〕。這種內源性病因導致的皮膚潰瘍又因為創傷處相關生長因子異常表達而出現延遲愈合，反復發作等情況〔4〕。因而，治療本類皮膚潰瘍的關鍵在于恢復創傷處的相關細胞生長因子表達，維護病變區域組織生長、恢復相關調控機制的平衡。

中醫學者認為DM內源性皮膚潰瘍屬于陰證瘡瘍，其病機為陽衰陰虧，治療需以溫陽益氣、活血生機為主〔5〕。《素問·陰陽應象大論》中提到：“陰陽者，萬物之能使也”，“陽化氣，陰成形”，認為陽氣是血肉肌膚生成的關鍵〔6〕。TGF-β的主要功能表現為促纖維細胞增殖，促趨化炎癥細胞聚集，調節細胞外基質合成，促肉芽組織生長及表皮生成〔7〕。已有研究顯示，外源性TGF-β在誘導上皮細胞增殖，加速角化運動，增強角蛋白表達上具有顯著效果〔8〕。IL-6則是前炎性介質的一種，是機體抗菌炎癥反應的重要參與因子，對內皮細胞、成纖維細胞增殖具有重要作用。IL-6還可調節免疫應激反應進而促進相關細胞分化、增殖，最終參與創面修復。本研究提示回陽生肌膏聯合重組人表皮生長因子治療內源性大鼠皮膚潰瘍療效最佳，大鼠創傷區域相關生長、修復因子明顯高表達。VEGF是血管內皮細胞特異有絲分裂原，是目前公認的最強促血管生成因子。VEGF可通過自分泌和旁分泌方式促進血管內皮細胞分化、趨化〔9〕。eNOS是存在于內皮細胞、巨噬細胞等細胞中的一種同工酶，具有調節血管功能的效果。回陽生肌膏由肉桂、炮姜、黃芪、人參、當歸等藥組成〔10〕。現代醫學研究發現，當歸等活血藥物在促VEGF表達，加速內皮細胞增殖、分裂、遷移上具有極高療效，可以有效促進人體血運，防止血管缺血壞死，并且還可以促進新生血管生成〔11〕。重組人表皮生長因子對機體多種組織細胞具有極強的促分裂作用。創面修復主要通過肉芽填充完成，而肉芽組織則主要由纖維細胞、新生血管構成。因此，加強創面纖維細胞增殖及新生血管生成是創面治療的根本〔12〕。