血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑對慢性阻塞性肺疾病大鼠炎癥反應的抑制作用

張 萍 邢琳琳 阮 昕 寧學聰 鞏翠珂 王志華 孫武裝

(邢臺市人民醫院呼吸內科，河北 邢臺 054001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)主要累及肺實質、肺血管及氣道〔1〕。目前研究顯示炎癥反應是COPD發生的主要原因之一，炎癥細胞被激活后釋放大量炎癥因子浸潤肺組織、氣道甚至全身機體，進一步參與COPD的發生發展〔2〕。血管活性物質血管緊張素(Ang)Ⅱ是一種重要的血管及氣道收縮因子，AngⅡ在COPD過程中大量分泌并釋放，導致肺組織進一步損傷〔3〕。有研究表明AngⅡ能活化受體型的酪氨酸激酶，還能夠激活血小板，誘導TXA2表達，促進炎癥因子釋放，對靶組織等造成損傷〔4，5〕，AngⅡ可能對COPD的炎癥反應起重要作用。本研究旨在探討AngⅡ在COPD中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 50只(200±20)g的SD雄性大鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證書：SCXK(滬)2012-0002，大鼠自由飲食和攝水。

1.2主要試劑及儀器 氯沙坦鉀片，規格：50 mg，浙江華海藥業股份有限公司；脂多糖(LPS)購自北京索萊寶生物技術有限公司；兔抗JAK2，信號轉導與轉錄激活因子(STAT)3，p-STAT3及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；白細胞介素(IL)-1β、干擾素(IFN)-γ、IL-4、IL-6、IL-10、基質金屬蛋白酶(MMP)-9、MMP抑制劑(TIMP)-1酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物技術有限公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；ELX800酶標分析儀購自美國Bio-Tek公司。

1.3建模及分組〔6〕50只大鼠隨機分為正常組，模型組，氯沙坦低、中、高劑量組，每組10只。其中模型組及氯沙坦組均采用反復煙熏+氣管內兩次滴加LPS復制COPD大鼠模型：大鼠置于玻璃煙熏箱內，每天3次，每次30 min，每次間隔6 h，連續28 d，向煙熏箱內注入香煙煙霧。同時在第1、14天，將大鼠麻醉，沿著氣管一次性緩慢注入200 μg/ml LPS，體積200 μl。而正常組大鼠照常飼養。在每天煙熏前30 min，氯沙坦組大鼠分別給予灌胃5、10、20 mg·kg-1·d-1氯沙坦，正常組及模型組給予等量生理鹽水，連續28 d。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)及標本的獲得 第28天麻醉大鼠，將大鼠右支氣管結扎，用生理鹽水沖洗大鼠左肺支氣管肺泡3次，離心并重懸，灌洗液用于總白細胞數、中性粒細胞、巨噬細胞及淋巴細胞的計數。另外取右肺組織并剔除脂肪組織，清洗干凈血跡，用于細胞因子及蛋白的檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色 右肺組織標本4%多聚甲醛固定，石蠟包埋并進行切片后，于二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精，蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。

1.6ELISA法檢測IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-9、TIMP-1含量 取部分右肺組織，勻漿離心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min離心10 min，收集上清液，取上清液嚴格按照試劑盒說明書檢測。

1.7Western印跡檢測JAK/STAT信號通路相關蛋白表達 取肺組織標本，勻漿機勻漿后離心，加入細胞裂解液裂解，4℃離心機離心，收集上清液即總蛋白，并測定蛋白濃度。制作5%濃縮膠，12%分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，取30 ng左右上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉膜。一抗溶液(兔抗JAK2、STAT3、p-STATF3及GAPDH多克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統中曝光。

1.8統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組肺組織病理形態 正常組肺組織及支氣管結構完整，未見異常；模型組肺泡斷裂，肺泡間隔變窄，有大量炎性因子浸潤；氯沙坦組肺泡結構較為完整，炎性因子浸潤減少，肺泡間隔變寬。

2.2各組BALF中各類細胞數目 與正常組比較，模型組中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞、白細胞總數均顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組均顯著降低(P<0.01)。見表1。

2.3各組肺組織中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量 與正常組比較，模型組IL-1β、IFN-γ及IL-6含量顯著升高，IL-4及IL-10含量顯著降低(均P<0.01)。與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組中IL-1β、IFN-γ及IL-6含量顯著降低，IL-4及IL-10含量均顯著升高(均P<0.01)。見表2。

2.4各組肺組織MMP-9及TIMP-1含量 與正常組比較，模型組MMP-9含量明顯提高，TIMP-1含量明顯降低(均P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦低、中、高劑量組MMP-9含量明顯降低，TIMP-1含量明顯提高(均P<0.01)。見表1。

表1 各組BALF中各類細胞數及肺組織MMP-9、TIMP-1含量比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；下表同

表2 各組肺組織中IL-1β、IFN-γ、IL-4、IL-6及IL-8含量比較

2.5各組肺組織JAK/STAT信號通路指標表達 與正常組(0.11±0.01，0.32±0.03)比較，模型組JAK2及p-STAT3表達量(1.12±0.11，0.45±0.04)明顯上調(P<0.01)；與模型組比較，氯沙坦中、高劑量組JAK2表達量(0.42±0.04、0.28±0.03)明顯下調(P<0.01)，低劑量組(1.10±0.18)差異無統計學意義(P>0.05)，而低、中、高劑量組p-STAT3表達量(0.38±0.04、0.27±0.03、0.18±0.02)明顯下調(均P<0.01)。見圖1。

圖1 各組肺組織JAK/STAT信號通路指標表達

3 討 論

研究表明，肺血管收縮反應性增強及肺血管重構所引起的肺循環失衡是COPD發生、發展的重要病理基礎，其中COPD所引起的肺血管內皮損傷進而導致的血管收縮及舒張之間的失衡是其主要的表現形式〔3〕。AngⅡ是常見的肺血管及氣道收縮因子，COPD或急性肺損傷過程中由于缺血缺氧，酸中毒引起了AngⅡ的大量分泌與釋放，加重了肺損傷〔4，5〕。AngⅡ同時還能誘導中性粒細胞等炎性細胞的聚集，進而調控黏附因子、趨化因子、細胞因子等多種炎癥介質表達，延長組織的損傷時間，參與機體的炎癥反應〔4，5〕。AngⅡ主要通過與AngⅡ受體(1型和2型)結合，發揮其生物學調控作用。因此通過拮抗AngⅡ與AngⅡ受體的結合，或者降低AngⅡ受體含量均能一定程度上遏制AngⅡ的誘導作用。本研究表明氯沙坦對吸煙引起的COPD小鼠肺損傷具有顯著的保護作用，但是具體作用機制未知〔7〕。另外研究還發現氯沙坦能夠減輕LPS引起的急性SD大鼠肺損傷，與降低細胞間黏附分子(ICAM)-1表達有關〔8〕，提示氯沙坦可能對COPD炎癥反應具有抑制作用。

吸煙是目前COPD發生的最為重要的因素之一，煙霧顆粒或有害顆粒致使肺部產生嚴重的炎癥反應。因此通過反復的煙熏及氣道滴加LPS成為COPD造模的主要手段，此方法成功率高，且動物肺組織病理變化與人類類似〔6〕。本研究結果表明氯沙坦能顯著恢復大鼠肺組織形態，改善肺泡結構，同時還能降低炎癥細胞浸潤，減少炎癥細胞的分泌；氯沙坦能顯著抑制百草枯急性染毒大鼠肺組織損傷，減輕炎癥細胞浸潤，并增加肺泡間厚度。COPD過程中肺泡灌洗液(BALF)中中性粒細胞、單核巨噬細胞、白細胞、淋巴細胞釋放大量的促炎因子(IL-1β、IFN-γ、IL-6)，而分泌較少的抗炎因子(IL-4、IL-10)。另外炎癥細胞還分泌大量的MMPs(MMP-9)，MMP-9不僅降解了肺細胞外基質，使肺細胞壁變薄，還使細胞分泌大量黏液，同時縮短了肺細胞間隙，又促使中性粒細胞、白細胞等炎癥細胞穿過血管向肺細胞進一步的浸潤，加重肺組織炎癥損傷。而正常生理情況下，MMPs與TIMP以1∶1的比例結合，進而處于動態平衡，保證細胞外基質成分的穩定，而在COPD過程中MMP-9大量分泌的同時，TIMP-1的分泌量大大減少。

另外大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6等能夠激活多種炎癥信號通路參與機體的炎癥反應，如JAK/STAT信號通路。此信號通路是由酪氨酸激酶JAK和轉錄因子家族STAT構成，當JAK受體與酪氨酸激酶受體IL-1β、IL-6結合形成二聚體后，JAK激酶被活化后，能夠使JAK受體上的酪氨酸殘基發生磷酸化，并與周圍氨基酸序列形態特定位點，招募含有SH2結構域的STAT蛋白，進而使STAT磷酸化，進入細胞核，促進炎癥因子轉錄，加重COPD炎癥反應。同時研究還發現AngⅡ還能激活JAK2/STAT3信號通路，參與高血壓、動脈粥樣硬化的發生發展〔9，10〕，提示氯沙坦可能與JAK2/STAT3信號通路密切相關。本研究結果表明氯沙坦能顯著下調JAK2及p-STAT3表達。

綜上，AngⅡ受體拮抗劑氯沙坦能顯著改善COPD大鼠肺組織形態，降低炎癥細胞浸潤，減少炎癥細胞分泌，降低促炎因子IL-1β、IFN-γ、IL-6及MMP-9分泌，提高抗炎因子IL-4、IL-10及TIMP-1分泌，進而抑制COPD炎癥反應，此過程可能與阻斷JAK2/STAT3信號通路有關。