糖尿病大鼠心肌組織中自噬基因微管相關蛋白1輕鏈3的表達

劉曉健 陳睿琦 胡 峰 張秀冰 曾慶紅 王 藝 崔秀玲

(錦州醫(yī)科大學藥理學教研室，遼寧 錦州 121001)

自噬基因微管相關蛋白1輕鏈(LC)3是自噬的標志物，自噬形成時，胞漿型LC3(LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽，轉變?yōu)樽允审w膜型(LC3-Ⅱ)。研究表明在多種疾病的發(fā)生發(fā)展與治療過程中均可有自噬水平的變化〔1,2〕。糖尿病(DM)心肌病是DM的重要并發(fā)癥。Lee等〔3〕研究表明，持續(xù)的高糖環(huán)境心肌細胞出現(xiàn)明顯自噬，可能促進DM心肌病的發(fā)生。而另有學者認為DM心肌中自噬不足促進了DM心肌病的發(fā)生發(fā)展，增強自噬可延緩心功能的損傷〔4,5〕。Xu等〔6〕報道心肌中自噬潮的減少是DM過程中的一種適應性反應，有自噬缺陷的DM心肌損傷反而減弱，增加自噬卻加重了DM心肌損傷。Kanamori等〔7〕報道Ⅱ型DM小鼠心肌中自噬減少，而Ⅰ型DM小鼠心肌中自噬卻增多。本研究探討DM心肌損傷過程中自噬的變化。

1 材料與方法

1.1動物及模型建立 健康雄性SD大鼠125只(購自遼寧長生生物技術有限公司，SYXK(遼)2014-0010)，8周齡，體重(245±20)g。適應性喂養(yǎng)1 w后，對照組(NC組)49只注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；DM模型組(DM組)86只以尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg，于注射后72 h測定空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L作為DM大鼠成模標準。造模成功72只，最終死亡8只，有1只出籠和16只因飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)血糖回落于標準以下被剔除。飼養(yǎng)期間，所有動物自由飲水、進食，每周監(jiān)測體重和尾靜脈血葡萄糖等情況。兩組分別在成模后第10、20、30、40、60、80、100天，以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，結束動物飼養(yǎng)。

1.2心肌標本收集 麻醉狀態(tài)下迅速取出大鼠心臟，預冷的生理鹽水洗去血液，濾紙吸干水分，稱量心臟重量，計算心重指數(shù)(心臟/體重，mg/g)。分離左心室組織，取部分心肌組織快速放入-80℃冰箱凍存，待測蛋白表達。另取一部分左心室組織放入新配制的4%多聚甲醛固定液中，待進行石蠟切片的形態(tài)學檢測。

1.3心肌組織病理學檢測 取石蠟包埋切片，行普通蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察兩組各時間點心肌組織形態(tài)學改變。

1.4Western印跡檢測蛋白表達 冰上操作眼科剪刀剪碎心肌組織后，加入含有1%蛋白酶抑制劑cocktail(美國Sigma公司)的RIPA裂解液(碧云天試劑公司)，超聲碎裂組織后再在冰上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min。取上清，二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。與5倍樣品緩沖液混合后,煮沸5 min。各個樣品取等量總蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯凝膠中電泳后轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h后,按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(美國Santa Cruz公司)、LC3B抗體(美國Sigma公司)，4℃搖床孵育過夜。二抗(1∶8 000稀釋)室溫作用1 h后，電化學發(fā)光(ECL)法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0軟件進行ANOVA 和LSD檢驗。

2 結 果

2.1兩組體重、FBG水平變化 DM組在造模后體重不再增加，甚至呈現(xiàn)明顯減少，多食、多飲，多尿、時有稀便，毛色暗淡，病程達60 d后，個別大鼠開始出現(xiàn)眼睛發(fā)白，80 d后，多數(shù)大鼠有明顯的眼睛白色變。NC組一切正常，毛色光亮，體格健康，無死亡，見表1。

2.2兩組不同時期心重指數(shù)比較 隨著鼠齡的增長，NC組心重指數(shù)稍有降低，而DM組明顯升高。40 d開始，與同時間點NC組相比，DM組心重指數(shù)顯著增加(P<0.01，P<0.05)，見表1。

2.3兩組心肌組織形態(tài)學變化 NC組各時間點心肌組織的HE染色，在光鏡下觀察未見顯著差別，心肌纖維走行整齊而致密。DM組在20 d時，心肌纖維走行基本整齊，與NC差別不明顯；而在40 d時，偶見心肌纖維分布較疏松，走行稍有紊亂或呈收縮狀改變；在80 d時，心肌纖維分布疏松和紊亂更為顯著，見圖1。

表1 兩組體重、FBG、心重和心重指數(shù)比較

與同時間點NC組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖1 兩組心肌組織HE染色(×400)

2.4兩組心肌組織中LC3-Ⅱ表達 NC組隨鼠齡的增加，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達呈現(xiàn)增多的趨勢，10 d時1.00±0.00，20 d 1.11±0.11，30 d 1.11±0.08，40 d 1.27±0.12，60 d 1.49±0.08，80 d 1.52±0.12，100 d 1.58±0.15，從40 d開始與第10天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。DM組隨著病程的發(fā)展，LC3-Ⅱ的蛋白表達表現(xiàn)為先稍增加，10 d 1.00±0.00,20 d 1.06±0.07,30 d 1.08±0.07,40 d 0.93±0.07，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而后明顯減弱，60 d 0.83±0.07,80 d 0.72±0.08,100 d 0.67±0.08(P<0.05,P<0.01)。與相同時間點NC組比較，DM組心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達在20 d時有增多趨勢(1.00±0.00 vs 1.13±0.05)，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.059 7)；40 d呈現(xiàn)降低趨勢(1.15±0.03 vs 1.10±

0.04)，較20 d差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，至80 d時DM組(0.76±0.02)明顯低于NC組(1.38±0.05，P<0.01)，見圖2，圖3。

圖2 兩組不同時間點心肌組織LC3-Ⅱ蛋白表達

圖3 兩組心肌組織LC3Ⅱ的蛋白表達比較

3 討 論

據(jù)不完全統(tǒng)計，DM心肌病臨床發(fā)生率約75%，但其發(fā)生機制尚未完全明了。目前研究認為，早期DM心肌病發(fā)生主要是由于線粒體損傷、細胞能量代謝異常、脂毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、細胞凋亡等機制參與，而氧化應激參與(DC)發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)〔7，8〕。

自噬過程是維持細胞合成、分解和結構重復利用必不可少的步驟。它不僅僅幫助細胞實現(xiàn)氨基酸的再循環(huán)，也幫助清除受損的細胞器，因而消除氧化應激，使細胞重塑而生存。LC3最初合成為未加工的形式pro-LC3，被轉化成酶處理的形式LC3-Ⅰ，最終被修改成PE共軛的形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬小體結構可信賴的蛋白質標志〔9〕。

本研究結果顯示，DM組心肌組織中LC3的蛋白表達顯著減少，表明自噬水平降低，與近來較多研究結果一致〔4,6〕。本研究結果還顯示，正常的大鼠隨著鼠齡增長，心肌組織中LC3-Ⅱ的蛋白表達增多，與Xu等〔6〕報道不一致，可能與實驗動物的種類和年齡不同有關。關于自噬水平在DM心肌病變中作用的不同結論，可能與不同齡的實驗動物DM模型有關，Lee等〔3〕以幼年動物為實驗對象，結果顯示自噬促進了DM心肌病變的發(fā)展。

本研究結果提示隨著DM的病程發(fā)展，心肌組織難以維持一定水平的自噬，可能正是由于自噬的明顯減少，DM大鼠的心肌組織不能實現(xiàn)氨基酸的再循環(huán)及清除受損的細胞器，不能使細胞有效重塑，從而出現(xiàn)顯著的心肌組織損傷。