重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的變化及甘露糖的干預效果

姚金鋒 白 婧 郭 昱 崔東來

(河北醫科大學第二醫院消化內科，河北 石家莊 050000)

重癥急性胰腺炎病理變化復雜，病情比較危重，死亡率較高〔1,2〕。重癥急性胰腺炎的炎癥反應除損害胰腺組織外，對鄰近組織器官也有損害作用。腸道黏膜屏障由生物屏障、化學屏障、免疫屏障和機械屏障構成，是維持機體內環境穩定的重要屏障，可以防止腸道內病原體和有害物質進入體內。急性胰腺炎時腸黏膜上皮細胞膜和細胞之間的機械屏障被破壞，從而引起腸黏膜屏障損傷〔3,4〕，但急性胰腺炎引起腸黏膜屏障損傷的機制尚不十分清楚。甘露糖具有抑制傷口愈合處炎癥反應及抑制中性粒細胞氧化爆發的作用。本文對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜免疫屏障的變化情況進行研究，并對其給予甘露糖治療，觀察甘露糖對重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損害的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：清潔級、雄性、SD大鼠30只，體重270～310 g，實驗前常規飲水和進食。主要試劑和儀器：牛磺膽酸鈉、D-甘露糖(美國Sigma公司)，大鼠分泌性免疫球蛋白(sIg)A放射免疫分析試劑盒、大鼠甘露糖結合凝集素(MBL)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒、大鼠白細胞介素(IL)-4 ELISA試劑盒(上海西塘生物有限公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1分組 將30只大鼠隨機分為假手術組、胰腺炎組(重癥急性胰腺炎組)和甘露糖組(重癥急性胰腺炎+甘露糖干預組)，每組10只。

1.2.2重癥急性胰腺炎模型的建立 采用戊巴比妥鈉對大鼠進行腹腔內麻醉，麻醉成功后常規備皮消毒，取各大鼠上腹部正中切口進入腹腔，分離膽胰管并結扎膽胰管肝門端。暴露并分離膽胰管十二指腸端，膽胰管內進針動靜脈留置針，結扎后拔除針芯，向膽胰管內以0.2 ml/min速度注射3%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)，見胰腺腫脹壞死后向空腸內注射氯化鈉溶液，0.5 ml/100 g，然后拔出穿刺針，逐層關腹。甘露糖組大鼠在重癥急性胰腺炎模型造模成功后經尾靜脈注射10%D-甘露糖。假手術組大鼠僅開腹、翻動胰腺和腸管、穿刺、關腹。

1.2.3標本制備 三組大鼠術后均經背部皮膚補液，術后12 h麻醉各組大鼠，進腹后經下腔靜脈穿刺采血用于內毒素、淀粉酶、瘦素水平和sIgA、MBL、IL-4水平測定，取材胰腺和回腸末端進行相應檢查。

1.2.4胰腺組織和回腸末端組織的病理學檢查 進腹后，肉眼觀察胰腺及腹腔各臟器的大體變化情況。HE染色：將胰腺和回腸末端組織用甲醛固定，制備石蠟標本，常規進行HE染色，觀察胰腺和回腸末端組織的病理學變化。

1.2.5胰腺組織和腸黏膜組織病理評分 胰腺組織根據水腫、壞死、出血及炎癥細胞浸潤情況評價病理損傷程度，每項分值為0～4分，各項分值總和為病理評分；腸黏膜病理評分：根據腸黏膜損傷評分方法對腸黏膜進行病理評分，腸黏膜絨毛正常為0分；絨毛頂端上皮下出現間隙伴毛細血管充血為1分；上皮下間隙擴大、固有層重度水腫、乳糜管擴張為2分；腸黏膜上皮層細胞變性壞死、固有層水腫明顯為3分；上皮細胞層變性壞死、毛細血管充血擴張，固有層裸露為4分；固有層崩解、絨毛脫落為5分。

1.2.6血內毒素、淀粉酶、瘦素水平測定 采用改良鱟實驗方法測定血內毒素水平；采用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶水平；采用放射免疫法測定血清瘦素水平。

1.2.7血清sIgA、MBL、IL-4水平測定 采用放射免疫法測定血清sIgA水平；采用ELISA法測定血清MBL和IL-4水平。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，多組均數比較采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1三組大鼠術后情況 術后假手術組大鼠無死亡，狀態良好，肌力正常，活動敏捷；胰腺炎組大鼠2只死亡，一般狀態差，飲水進食差，精神萎靡，反應遲鈍；甘露糖組大鼠1只死亡，一般狀態尚可，飲水進食較胰腺炎組好，反應較胰腺炎組敏捷。

2.2三組大鼠大體病理變化 假手術組大鼠腹腔內器官正常，無腹水；胰腺炎組大鼠胃腸脹氣比較明顯，見大量淡黃色或淡紅色腹水，胰腺呈暗紅色，大片出血壞死，見皂化斑；甘露糖組大鼠胃腸脹氣較胰腺炎組輕，胰腺呈暗紅色，見片狀出血壞死，偶見皂化斑。

2.3三組大鼠胰腺組織HE染色 術后12 h，假手術組大鼠見散在水腫細胞，偶見出血壞死，無炎癥細胞浸潤；胰腺炎組大鼠胰腺組織結構紊亂，間質彌漫性水腫，胰腺腺泡細胞較多壞死，見片狀出血灶，有大量炎癥細胞浸潤；甘露糖組大鼠胰腺組織結構比較清晰，見區域性水腫，少量出血灶和壞死細胞，少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 三組大鼠胰腺組織HE染色(×200)

2.4三組大鼠腸黏膜HE染色 假手術組大鼠腸黏膜絨毛和上皮形態完整，未見明顯損傷；胰腺炎組大鼠腸黏膜固有層水腫，絨毛頂端脫落，形態不規則，腸黏膜上皮細胞壞死；甘露糖組大鼠腸黏膜固有層水腫較胰腺炎組輕，絨毛形態不規則和上皮細胞壞死較胰腺炎組輕。見圖2。

圖2 三組大鼠腸黏膜HE染色(×200)

2.5三組大鼠胰腺病理學評分和腸黏膜病理學評分比較 三組大鼠胰腺病理學評分和腸黏膜病理學評分比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組大鼠胰腺病理學評分和腸黏膜病理學評分均高于假手術組(P<0.05)，甘露糖組大鼠胰腺病理學評分和腸黏膜病理學評分低于胰腺炎組(P<0.05)。見表1。

2.6三組大鼠血清內毒素、淀粉酶、瘦素水平比較 三組大鼠血清內毒素、淀粉酶、瘦素水平比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組血清內毒素、淀粉酶、瘦素水平均高于假手術組(P<0.05)，甘露糖組大鼠血清內毒素、淀粉酶、瘦素水平低于胰腺炎組(P<0.05)。見表2。

表1 三組胰腺病理學評分和腸黏膜病理學評分比較分)

與假手術組比較:1)P<0.05;與胰腺炎組比較:2)P<0.05；下表同

表2 三組大鼠血清內毒素、淀粉酶、瘦素水平比較

2.7三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較 三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，其中胰腺炎組和甘露糖組血清sIgA、IL-4水平均低于假手術組(P<0.05)，甘露糖組血清sIgA、IL-4水平高于胰腺炎組；胰腺炎組和甘露糖組血清MBL水平均高于假手術組(P<0.05)，甘露糖組血清MBL水平高于胰腺炎組(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比較

3 討 論

重癥急性胰腺炎時多種原因均可引起腸黏膜屏障功能障礙，引起腸道內細菌移位，腸道內的內毒素和細菌進入血液循環后激活單核-巨噬細胞，釋放大量的炎癥介質和細胞因子，引起全身炎癥反應綜合征的發生。重癥急性胰腺炎患者幾乎都有不同程度的腸黏膜屏障功能障礙，隨著病情的進展，可對腸道造成不可逆損傷，腸黏膜屏障功能障礙使腸道通透性增加，腸道內的內毒素和細菌穿過腸黏膜，浸入腸壁、門靜脈、腸系膜淋巴結等部位，發生細菌易位〔5～7〕。重癥急性胰腺炎時革蘭陰性菌數量增加，附著在腸壁，釋放大量內毒素，引起腸道屏障損傷〔8,9〕。瘦素具有廣泛的生物學作用，胰腺組織中存在有瘦素受體，在急性胰腺炎中瘦素發揮重要作用，胰腺炎患者瘦素水平升高〔10,11〕。sIgA水平代表局部體液免疫功能，是黏膜局部免疫反應的主要抗體。sIgA主要在黏膜上層黏液中存在，和肝膽疾病、呼吸道疾病、消化道疾病、泌尿生殖道疾病等多種疾病有關。在腸道內，sIgA能夠抵抗蛋白水解，參與消化道黏膜防御作用，sIgA水平下降表示局部免疫功能下降〔12,13〕。MBL由肝臟合成，為一種急性期蛋白，對吞噬和炎癥具有調節作用，和多種感染性疾病、自身免疫性疾病的發生有關〔14,15〕。IL-4為細胞因子之一，可以增加sIgA的分泌，增加機體體液免疫功能。在腸道組織中IL-4來自腸道固有層，可以抑制炎性細胞活化，減少炎癥因子釋放，從而發揮抗炎作用〔16〕。本文結果發現：重癥急性胰腺炎大鼠胰腺出現嚴重炎癥反應，腸黏膜組織受到破壞，血清內毒素、淀粉酶、瘦素、MBL水平升高，血清sIgA、IL-4水平下降。可見，重癥急性胰腺炎大鼠模型存在腸黏膜屏障功能障礙。

甘露糖是一種六碳糖，在糖代謝過程中磷酸化生成甘露糖-6-磷酸，是臨床上唯一應用的糖質營養素，在機體內分布廣泛，在腸、肝、視網膜、神經等部位均有分布，參與機體的免疫調節，抵抗細菌感染、抑制巨噬細胞炎癥、促進傷口愈合而發揮抗炎作用。本文結果發現，甘露糖可以減輕重癥急性胰腺炎大鼠胰腺炎癥反應，保護腸黏膜免疫屏障，其保護作用可能和甘露糖刺激肝臟分泌MBL，從而增加sIgA、IL-4水平有關。