TSC1在膀胱尿路上皮癌中的表達及其臨床意義

賈亞濤 鄧 飛 李紅飛 王艷波 姜鳳鳴

(吉林大學第一醫院泌尿外科,吉林 長春 130021)

膀胱癌是泌尿生殖系統中常見的惡性腫瘤，術后容易復發且預后較差。TSC1編碼的錯構瘤蛋白(hamartin)為腫瘤抑制基因，在細胞的生長、增殖、分化、遷移、凋亡等各方面發揮重要作用。研究發現TSC1的編碼產物hamartin在膀胱癌的發生及發展過程中發揮著極其重要的作用〔1〕。本實驗擬分析TSC1在膀胱尿路上皮癌組織中的表達及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般材料 選取吉大一院泌尿外科2014年1月至2016年1月行經尿道膀胱腫瘤電切術切除的病理切片51例，均經病理證實為膀胱尿路上皮癌。其中男36例，女15例；年齡≤60歲19例，>60歲32例；腫瘤直徑≤3 cm 36例，>3 cm 15 例；病理分級(采用WHO2004年分級法)：低分級27例，高分級24例；臨床分期(采用國際抗癌協會2002年TNM分期法)：Ta-T1期：42例，T2期：9例。另取5例經病理證實為正常膀胱組織的病理切片作為對照組，男3例，女2例，年齡≤60歲1例，>60歲4例。

1.2主要器材和試劑 主要器材：(1)石蠟切片機(上海華駿醫療器材有限公司)；(2)光學顯微鏡(上海點應光學儀器有限公司)；(3)冰箱(廣東美的集團)；(4)自動攝像顯微鏡(深圳奧斯微光學儀器有限公司)；(5)微波爐(廣東美的集團);(6)恒溫水浴箱(江蘇金環試驗設備有限公司)；(7)10、100、1 000 μl微量加量器(上海高鴿工貿有限公司);(8)10、100、1 000 μl吸頭(上海晶安生物科技有限公司);(9)100.5 ml及1.5 ml EP管(上海百千生物科技有限公司)。主要試劑：(1)一抗兔來源TSC1抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；(2)SP免疫組化試劑盒(南京建成生物工程研究所)；(3)二甲苯(北京博奧森生物技術有限公司)；(4)乙醇(北京博奧森生物技術有限公司)；(5)無水甲醇(北京博奧森生物技術有限公司)；(6)30%過氧化氫(H2O2)(北京博奧森生物技術有限公司)；(7)蘇木精染液(北京博奧森生物技術有限公司)；(8)封片膠(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.3方法 (1)在石蠟標本的最佳部位切3張厚度均為2 μm的切片，制成標本。(2)用二甲苯常規對標本脫蠟、入水和抗原修復。染色前用磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡10 min。(3)把標本放入3%H2O2-甲醛中浸泡10 min，以便消除內源性過氧化氫酶的作用。(4)用PBS沖洗3次，每次2 min。(5)加一滴試劑A于組織切片標本上，孵育10 min。(6)倒掉或吸干液體。(7)每張切片加100 μl一抗，在4℃的濕盒內過夜。(8)用PBS沖洗標本3次，每次2 min。(9)加一滴試劑B于每張標本上,孵育10 min。(10)用PBS洗標本3次，每次2 min。(11)加一滴試劑C于每張切片,孵育10 min。(12)用PBS洗標本3次，每次2 min。(13)加一滴上述二氨基聯苯胺(DAB)顯色液于每張組織切片標本上，室溫下顯色2～5 min。 (14)用自來水充分沖洗。(15)蘇木素復染。(16)組織切片經梯度酒精水干燥、透明、中性樹膠封片、鏡檢。

1.4結果判定標準 TSC1在胞質中表達，呈棕黃色或棕褐色。根據陽性細胞的比例及著色程度進行綜合評分，陽性細胞比例<30%為1分，30%～60%為2分，>60%為3分；細胞著色程度：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。根據陽性細胞比例和細胞著色程度的乘積進行統計分析：0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.5統計學分析 使用SPSS19.0統計軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1TSC1在膀胱癌及正常膀胱組織中的表達 在細胞質中出現彌漫分布的棕褐色或棕黃色顆粒即為TSC1表達陽性，見圖1。在膀胱癌組織中，30例(58.8%)呈陰性表達；而在正常膀胱組織中，均見TSC1正常表達；兩組差異有統計學意義(χ2=6.335,P=0.012)。

2.2TSC1 在膀胱癌組織的表達與臨床病理特征的關系 TSC1表達與臨床分期、病理分級有關(P<0.05)，與性別、年齡及腫瘤大小無關(P>0.05)。見表1。

2.3TSC1的表達與膀胱癌復發的關系 術后隨訪18～36個月，隨訪45例復發19例。在膀胱癌組織中，復發組TSC1陰性表達率〔14例(73.7%)〕明顯高于非復發組〔10例(38.5%)，P<0.05〕。

圖1 TSC1在膀胱尿路上皮癌組織中的表達(×400)

臨床病理特征n陰性表達(n=30)χ2值P值臨床分期 Ta-T1期4222(52.4)4.0780.043 T2期98(88.9)病理分級 低分級2712(44.4)4.8980.027 高分級2418(75.0)性別 男3621(55.3)0.120.912 女159(69.2)年齡 ≤60歲1911(57.9)0.110.917 >60歲3219(59.4)腫瘤大小 >3 cm159(60.0)0.120.912 ≤3 cm3621(58.3)

3 討 論

盡管約75%的膀胱癌患者在首次診斷時屬于早期腫瘤〔2，3〕，但50%～70%的膀胱癌患者會在術后1～2年內復發，且20%的復發腫瘤最后會進展為肌層浸潤性膀胱癌〔4〕。根據其復發和進展的風險，膀胱癌患者可分為低危、中危、高危人群〔5〕。研究發現，70%膀胱癌患者涉及某種特定基因的突變〔6〕，TSC1是與膀胱癌密切相關的腫瘤抑制基因〔7，8〕。TSC1基因發生突變導致其轉錄產物所編碼的hamartin截斷,翻譯的過程被提前終止，從而引起hamartin功能缺失或障礙,其穩定馬鈴薯蛋白及防止其變性的功能減弱甚至消失,調節細胞骨架過程的作用減弱,引起TOR不受調控和持續激活,對細胞周期的抑制作用隨之減弱,從而引起細胞異常黏附、生長及遷移,造成細胞的異常生長和過度增殖,最終導致腫瘤的發生。Edwards等〔9〕研究發現TSC1發生基因突變的膀胱癌患者會在更短的時間內復發。hamartin表達減少或降低的膀胱癌患者其發生進展的風險也更高，Mhawech-Fauceglia等〔10〕發現hamartin通過上調 p27 和14-3-3σ調節細胞的增殖過程參與膀胱癌的形成，從而推測hamartin可能用作預測膀胱癌的進展新指標。本實驗結果與Edwards等〔9,10〕研究結果較為一致。TSC1基因參與細胞周期的調控,其編碼的hamartin在胰島素信號通路中是關鍵環節,該通路在許多惡性腫瘤中異常激活,為此可為膀胱癌的有效治療提供新的靶點。定性定量的測定TSC1基因在膀胱癌組織的表達及突變情況,能夠對研究膀胱癌的發生、發展、治療、預后及轉歸提供重要的參考依據。