復(fù)方板藍(lán)根顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究*

譚敏潔，江 勛，彭婷婷，周 峰，傅黎春

（湖南省衡陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖南 衡陽(yáng) 421001）

復(fù)方板藍(lán)根顆粒是我國(guó)常用非處方中成藥，由板藍(lán)根和大青葉經(jīng)提取精制而成[1]。板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)Isatis indigotica Fort．的干燥根[2]，含有大量生物堿、氨基酸、有機(jī)酸、核苷、多糖等[3-4]。大青葉為十字花科菘藍(lán) Isatis indigotica Fort．的干燥葉[2]，其有效成分與板藍(lán)根基本類似，主要含吲哚類生物堿、有機(jī)酸、苷類、甾醇等[5]。復(fù)方板藍(lán)根顆粒具有清熱解毒、涼血利咽的功效，主要用于溫病發(fā)熱、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎等[1]，臨床使用廣泛，療效明確。經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查證，全國(guó)共有153家生產(chǎn)企業(yè)。復(fù)方板藍(lán)根顆粒現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中僅有2個(gè)化學(xué)反應(yīng)鑒別，無(wú)專屬性指標(biāo)成分定性鑒別和定量測(cè)定方法，無(wú)法有效控制其質(zhì)量。板藍(lán)根中含18種氨基酸，其中精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、亮氨酸等含量高，具有抗病毒、抗炎功效[6-8]。靛藍(lán)、靛玉紅是大青葉的主要抑菌物質(zhì)[9]；（R，S）-告依春是板藍(lán)根的主要生物堿，具較強(qiáng)的抗病毒活性[10]；腺苷和尿苷是板藍(lán)根中具有抗病毒活性的核苷類成分[11]。參考文獻(xiàn)[12-15]方法及2015年版《中國(guó)藥典（一部）》板藍(lán)根和大青葉項(xiàng)下方法，以脯氨酸、亮氨酸、靛玉紅作為指標(biāo)成分，建立薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，以（R，S）-告依春和腺苷為指標(biāo)成分建立高效液相色譜法進(jìn)行定量測(cè)定，有利于對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行科學(xué)分析和評(píng)估，為提高產(chǎn)品質(zhì)量和保障療效提供數(shù)據(jù)支持和方法驗(yàn)證。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：AE 240型電子分析天平（Mettler公司）；DK-41OHT型超聲波清洗儀（深圳市得康洗凈電器有限公司）；薄層色譜版加熱器（CAMAG）；LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器和色譜工作站。

試藥：大青葉對(duì)照藥材（批號(hào)為121367-200602），板藍(lán)根對(duì)照藥材（批號(hào)為121177-201407），脯氨酸對(duì)照品（批號(hào)為140677-201507），亮氨酸對(duì)照品（批號(hào)為140687-201102），腺 苷 對(duì) 照 品 （批 號(hào) 為 110879-200202），（R，S）-告依春對(duì)照品（批號(hào)為 111753-201505），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國(guó)Honeywell公司）；薄層色譜預(yù)制硅膠G板（德國(guó)Merck公司）；復(fù)方板藍(lán)根顆粒[市售，共34批，規(guī)格為每袋15 g（相當(dāng)于原生藥15 g）]；超純水（湖南中沃水務(wù)環(huán)保科技有限公司）；其余試劑均為分析純（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

氨基酸：取本品2 g，研細(xì)，加乙醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取大青葉對(duì)照藥材、板藍(lán)根對(duì)照藥材各0．5 g，加乙醇20 mL，同法制得對(duì)照藥材溶液。再取脯氨酸對(duì)照品、亮氨酸對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》薄層色譜法試驗(yàn)，分別取對(duì)照品溶液2 μL、供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各 5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正丁醇 -冰醋酸 -水（19∶5∶5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1 A（S從上至下分別為亮氨酸、脯氨酸）。

靛玉紅：取本品15 g，研細(xì)，加氯仿40 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。取大青葉對(duì)照藥材0．5 g，加氯仿20 mL，加熱回流1 h，濾液濃縮至1 mL，制得對(duì)照藥材溶液。再取靛玉紅，加氯仿，制得每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》薄層色譜法試驗(yàn)，分別取對(duì)照品溶液5 μL、供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各 10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮（5∶4∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1 B。

2.2 定量測(cè)定

2．2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～5min，2% ～2%A；5～15min，2% ～10%A；15～20min，10% ～10%A；20～25 min，10% ～12%A；25～41 min，12% ～12%A；41～42 min，12% ～30%A；42～45 min，30% ～30%A）；流速：0．8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：245 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按（R，S）-告依春和腺苷峰計(jì)算均不低于10 000。在此色譜條件下，復(fù)方板藍(lán)根顆粒中的（R，S）-告依春和腺苷與其他組分均能達(dá)到基線分離，色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 薄層色譜圖

2．2．2 溶液制備

取（R，S）-告依春和腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每 1 mL 含（R，S）-告依春 19．6 μg，含腺苷62．88 μg的混合對(duì)照品溶液。取本品約4 g，置具塞錐形瓶中，精密加水25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，60℃超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz）45 min使溶解，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按照部頒標(biāo)準(zhǔn)中處方量及生產(chǎn)制備方法，分別制備不含板藍(lán)根、大青葉的樣品，按供試品溶液項(xiàng)下操作，得陰性對(duì)照品溶液。

2．2．3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取2．2．2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：分別取對(duì)照品溶液適量，加水稀釋成含（R，S）- 告依春 0．98，1．96，3．92，7．84，9．80，11．76，15．68，19．60 μg/mL，含 腺 苷 3．144，6．288，12．576，25．152，31．440，37．728，50．304，62．880 μg/mL的系列溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為20 μL，分別以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 高效液相色譜圖

1．（R，S）-告依春 2．腺苷

A．混合對(duì)照品溶液 B．供試品溶液

C．板藍(lán)根陰性對(duì)照品溶液 D．大青葉對(duì)照品溶液

表1 回歸方程、線性范圍、定量限和檢測(cè)限

定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液，用水依次稀釋成由高到低的溶液，測(cè)得（R，S）-告依春和腺苷的檢測(cè)限（S/N=3）和定量限（S/N=10）。結(jié)果見(jiàn)表1。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，精密吸取20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果（R，S）-告依春和腺苷色譜峰面積的 RSD分別為0．03%和0．11%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為160517）約4 g，精密稱定，分別于配制后 0，3，8，12，18，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液中（R，S）-告依春和腺苷的色譜峰峰面積的 RSD分別為1．13%和0．94%（n=6），表明供試品溶液制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為160517）樣品，精密稱定，分別依法制備6份供試品溶液，并測(cè)定含量。結(jié)果，（R，S）-告依春和腺苷的 RSD分別為 1．87%和1．65%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為160517）樣品9份，精密稱定，分別精密加入（R，S）-告依春和腺苷對(duì)照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2．2．4 樣品含量測(cè)定

分別取復(fù)方板藍(lán)根顆粒樣品約4 g，精密稱定，依法制成供試品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，每份樣品平行測(cè)定2次，計(jì)算（R，S）-告依春和腺苷含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

（R，S）-告依春和腺苷對(duì)照品溶液的紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果顯示，（R，S）-告依春在240 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，腺苷在258 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。綜合兩者及文獻(xiàn)[12-15]，選定245 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

表2 樣品中（R，S）-告依春與腺苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

表3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒成分定量測(cè)定結(jié)果

3.2 流動(dòng)相選擇

分別考察了甲醇-水、乙腈-水、0．02%磷酸-甲醇、0．1%磷酸-甲醇及0．1%磷酸-乙腈的等度和梯度洗脫，結(jié)果上述流動(dòng)相系統(tǒng)均可對(duì)單個(gè)成分達(dá)到較好的分離效果，但不能同時(shí)對(duì)2個(gè)成分進(jìn)行較好地分離。最終，選擇甲醇-水梯度洗脫，峰形好，且2個(gè)成分分離效果均比較滿意，流動(dòng)相本身干擾因素小，較等度方法效果更好，穩(wěn)定可靠。

3.3 提取方法選擇

（R，S）-告依春和腺苷均為水溶性成分，故選取純水為提取溶劑。分別在40℃和60℃條件下考查了提取時(shí)間為 30，45，60 min 時(shí)（R，S）-告依春和腺苷的含量，發(fā)現(xiàn)60℃提取45 min提取效果最佳。

3.4 樣品分析

收集到的34批復(fù)方板藍(lán)根顆粒樣品，經(jīng)檢測(cè)，有8批未檢出（R，S）-告依春或低于檢出限，（R，S）-告依春含量范圍為每袋0～0．422 9 mg，腺苷含量范圍為每袋 0．031 3～1．764 9 mg。不同樣品中（R，S）-告依春和腺苷含量差異較大。考慮不同廠家的復(fù)方板藍(lán)根顆粒有效成分含有量差異可能與原藥材有關(guān)，對(duì)收集來(lái)的5批板藍(lán)根中藥材和5批大青葉中藥材檢測(cè)（R，S）-告依春和腺苷含量，測(cè)得板藍(lán)根中藥材中（R，S）-告依春含量范圍為 1．186 1 ～3．452 0 mg/g，腺苷含量范圍為0．042 5 ～0．1880mg/g；大青葉中藥材（R，S）-告依春含量范圍為 0～0．053 3 mg/g，腺苷含量范圍為 0．031 3～0．173 7 mg/g。可見(jiàn)，不同來(lái)源的板藍(lán)根和大青葉中（R，S）-告依春和腺苷含量差異較大。原材料的有效成分含量直接影響復(fù)方板藍(lán)根顆粒制劑的質(zhì)量。34批復(fù)方板藍(lán)根顆粒樣品，有1批無(wú)論薄層鑒別和含量測(cè)定都無(wú)法得到陽(yáng)性結(jié)果，考慮和廠家投料真實(shí)性有關(guān)。

3.5 方法評(píng)價(jià)

復(fù)方板藍(lán)根顆粒臨床應(yīng)用廣泛，療效確切，但其質(zhì)量控制水平比較落后，制劑質(zhì)量差異很大，故對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提升非常有必要。選擇板藍(lán)根中抗病毒成分脯氨酸、亮氨酸和大青葉中主要抑菌成分靛玉紅作為薄層鑒別指標(biāo)，特征性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)單，利于制劑的質(zhì)量控制。以（R，S）-告依春為代表的生物堿和以腺苷為代表的核苷類成分具有很強(qiáng)的抗病毒活性，含量高，且為水溶性物質(zhì)，在復(fù)方板藍(lán)根制備工藝中能很好地溶出。以其作為指標(biāo)用高效液相色譜法進(jìn)行質(zhì)量控制，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，能保證復(fù)方板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量及療效。