參苓白術散高效液相色譜特征指紋圖譜研究及5個指標性成分的含量測定

劉彩君，朱 芹

（湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100）

參苓白術散由人參、甘草、茯苓、山藥、炒白術、桔梗、炒白扁豆、蓮子、砂仁、炒薏苡仁組方，以全原粉入藥制成復方制劑，具有補脾胃、益肺氣之功效，臨床多用于脾胃虛弱、食少便溏、氣短咳嗽，肢倦乏力等證候[1]，收載于2015年版《中國藥典（一部）》，屬于國家基本藥物目錄管理中成藥。目前，參苓白術散的質量標準并未收載含量測定項，只有性狀、鑒別和常規檢查項目，雖已有對方中某些成分進行含量測定的報道[2-4]，但測定成分比較簡單，不能全面、系統地反映其質量。中成藥常用多種藥材結合活性有效成分，具有多藥味、多靶點的特點[5]。傳統的單一成分研究已無法全面、真實、準確地對中成藥進行綜合質量評價。中藥及其制劑的指紋圖譜及特征圖譜是以了解中藥物質群的整體功能為基礎，借助色譜技術，可得到其化學成分的色譜圖，具有特征強、信息量大和整體性強的特點。它能有效地檢測和控制中成藥的真實性、穩定性和質量一致性，從而更全面地評價藥品質量，為有效控制藥品質量提供強有力的技術支持[6-8]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法建立參苓白術散的特征指紋圖譜，并同時測定人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、甘草苷、甘草酸5個指標性成分的含量，旨在全面分析、評價參苓白術散的質量，為該藥整體質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），包括在線脫氣機、四元梯度泵、自動進樣器、1260DAD檢測和Agilent-Chemistation數據處理系統；AUW-220D型電子天平（日本島津公司）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500 W）；DK-98ⅡA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1對照品（批號為110703-201731，含量以93．6%計），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704-201625，含量以 95．0%計），人參皂苷 Re對照品（批號為110754-201626，含量以97．4%計），甘草苷對照品（批號為 111610-201607，含量以 93．1% 計），甘草酸銨對照品（批號為 110731-201619，含量以 93．0% 計），人參對照藥材（批號為120927-201211，為五加科植物人參 Panax ginseng C.A.Mey．干燥根和根莖的粉末），甘草對照藥材（批號為120904-201620，為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch．干燥根和根莖的粉末），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。用于特征圖譜分析的11批參苓白術散分別購自3個不同的生產廠家，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件[9-11]

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0．05% 甲酸（B），梯度洗脫（表 2）；流速：1．0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

表2 流動相梯度洗脫與檢測波長

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋成每1 mL中分別含人參皂苷Rg126．31μg、人參皂苷 Rb135．34μg、人參皂苷 Re40．62μg、甘草苷 12．14 μg、甘草酸 25．62 μg（甘草酸質量 =甘草酸銨質量/1．020 7）的混合對照品溶液，用0．45 μm微孔濾膜濾過，備用。

供試品溶液：稱取參苓白術散，研細，混勻，取粉末約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（250 W，40 kHz）35 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，濾過。精密量取續濾液25 mL，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次25 mL。合并正丁醇液，蒸干，殘渣加70%甲醇適量分次溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，用0．45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：參照2015年版《中國藥典（一部）》參苓白術散處方，分別制備缺人參和甘草的陰性對照溶液，按供試品溶液制備方法制備溶液，搖勻，即得。

2.3 指紋圖譜方法學考察

精密度試驗：取批號為20170410（S4）的樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖。以甘草酸為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間的 RSD均小于0．5%（n=6），相對峰面積的 RSD均小于2．0%（n=6），6次采集到指紋圖譜（以第1次進樣色譜圖為參照）的相似度均大于0．9，表明儀器精密度良好。詳見表3。

重復性試驗：取批號為20170410（S4）的參苓白術散，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件，依次進樣測定，記錄色譜圖。以甘草酸為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間的 RSD均小于0．5%（n=6），相對峰面積的 RSD均小于2．0%（n=6），6份樣品指紋圖譜（以第1份樣色譜圖為參照）的相似度均大于0．9，表明方法重復性良好。

表3 參苓白術散相似度評價結果（n=6）

穩定性試驗：取批號為20170410（S4）的參苓白術散，依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按擬訂色譜條件，分別于 0，4，8，12，16，20 h 時進樣，記錄色譜圖。以甘草酸為參照峰，計算共有峰的相對保留時間及相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間的 RSD均小于 0．5% （n=6），相對峰面積的 RSD均小于 2．0%（n=6），6個時間段采集到指紋圖譜（以0 h時進樣色譜圖為參照）的相似度均大于0．9，表明供試品溶液在20 h內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2．4．1 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

取11批（S1-S11）參苓白術丸，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》對色譜圖進行分析，以樣品S4圖譜為參考圖譜，時間窗寬度設為0．2 min，采用多點校正后自動匹配指紋圖譜，并以平均數法生成對照指紋圖譜（見圖1），計算指紋圖譜相似度。由表3可見，11批供試品指紋圖譜和對照指紋圖譜相似度均大于0．9。說明不同廠家參苓白術散的化學組成一致性較好，質量相對穩定。

2．4．2 指紋圖譜共有峰指認及相對峰面積計算

通過中藥圖譜相似度評價系統軟件可以得出，所測試11批參苓白術散指紋圖譜共有峰14個。通過與陰性對照品溶液色譜峰比較，可以判定，1，5，6，13，14 號色譜峰來自甘草藥材，7，8，9，11，12 號色譜峰來自人參藥材；經過與混合對照品比對，可以指認其中5個成分，分別是5號峰甘草苷、6號峰甘草酸、8號峰人參皂苷Rg1、9號峰人參皂苷Re和12號峰人參皂苷Rb1，其保留時間分別為 9．589，15．753，19．449，20．021，26．214 min。6號峰（甘草酸）峰形較好，分離完全，出峰時間居中，因此以它作為參考峰，設定其相對峰面積為1，計算各共有峰相對峰面積。結果見表4。

表4 11批樣品共有峰相對峰面積

圖1 指紋圖譜及高效液相色譜圖

2.5 5種成分含量測定

2．5．1 溶液制備

按擬訂色譜條件同2．1項，以2．2項下方法制備混合對照品溶液、陰性對照品溶液和供試品溶液。

2．5．2 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取混合對照品溶液1，2，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以待測成分的進樣量（X，μg）為橫坐標，以對應峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程，結果見表5。

表5 5種成分回歸方程、相關系數（r）及線性范圍

精密度試驗：取同一批樣品（批號為20170410）溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、甘草苷和甘草酸峰面積的RSD 分別為 0．17% ，0．78% ，0．26% ，0．69% ，0．55%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批樣品（批號為20170410）溶液，分別于 0，4，8，12，16，20，24 h 時進樣，記錄色譜圖。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、甘草苷和甘草酸峰面積的 RSD分別為 0．25%，0．71%，0．63% ，0．36%，0．58% （n=6），表明供試品溶液在 24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為20170410），按2．2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、甘草苷和甘草酸平均含量分別為3．22，1．83，1．74，1．12，4．79 mg/g，RSD 分 別 為 0．17% ，0．89% ，0．62% ，0．53% ，0．97% （n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為20170410）共 6 份，每份約 0．25 g，精密稱定，分別精密加入不同量的對照品，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率。結果見表6。

2．5．3 樣品含量測定

取11批（S1-S11）參苓白術散，按2．2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，記錄色譜圖，計算含量，結果見表7。可見，同一廠家不同批號產品間各成分含量相對較穩定。

表6 參苓白術散5種成分加樣回收試驗結果（n=6）

表7 樣品含量測定結果（mg/g，n=11）

3 討論

3.1 提取溶劑和方法選擇

本試驗中考察了20%甲醇、50%甲醇和70%甲醇等溶劑對參苓白術散的提取效果，發現隨著甲醇濃度的升高，色譜峰數量也隨之增多，峰形也明顯改善，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。建立樣品制備方法時，也同時考察了索氏提取、回流提取、超聲提取等提取方法，結果顯示，所得色譜峰面積相差不大，而超聲提取操作簡單，檢出率高，最終選取超聲提取作為提取方法。

3.2 色譜柱選擇

分別吸取2．2項下供試品溶液10 μL，選用Agilent C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Thermo C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），Sunfire C18柱（250 mm × 4．6 mm，5 μm）及 Shimadzu VP-ODS 柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）4 根不同品牌的色譜柱，按擬訂色譜條件進樣，其中Agilent C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）色譜柱較其他色譜柱能獲得較多色譜峰，分離效果及峰形均較好，故選其作為研究用色譜柱。

3.3 方法評價

本研究中建立了參苓白術散HPLC指紋圖譜，共發現14個共有峰，通過與對照藥材色譜圖對比，指認其中的5種有效成分，同時測定了其含量，方法簡便快捷，科學實用，同時具備定性和定量兩重作用，能系統、快速地評價參苓白術散的藥品質量。