復方三草滴丸防治大鼠腎性貧血實驗研究*

何麗君，林向前 ，陳 豪 ，鄭婉玉，林善彬

（1．福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004； 2．福建省漳州市中醫院，福建 漳州 363000）

復方三草滴丸是由醫院協定處方三草湯劑型改造而來，由鬼針草、車前草、白茅根3味中藥組方。三草湯具有清熱解毒、消腫、散瘀的功效，用于治療瘧疾、腹瀉、跌打損傷、蛇蟲咬傷等[1-3]。抗蛇毒血清是公認的搶救和治療蛇傷用藥，但蛇傷多發生在農村，使用抗蛇毒血清有諸多不便，故我國救治蛇傷仍以中醫藥為主。三草湯是蛇傷專家黃守林獨創的經驗方，長期的臨床實踐證明，其對蛇傷等引起的腎損害具有明顯的保護作用。蛇傷等有時可導致急性腎功能衰竭（CRF），常見的臨床表現是腎性貧血，目前尚缺乏特效藥物[4-6]。《本草拾遺》曰：“鬼針草味苦，性平，無毒，具有清熱、解毒、散瘀、消腫作用。”[7]鬼針草作為復方三草滴丸的君藥，其有效成分主要是黃酮類，具有清熱解毒、活血化瘀、通脈降壓功效[8]。前期研究發現，鬼針草浸膏能改善腎衰竭患者的貧血癥狀和臨床指征[9-10]。本研究中采用慶大霉素皮下注射進行大鼠腎性貧血造模，為復方三草滴丸的藥效學研究提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：JZC-TSE-1．5L型電子天平（誤差范圍為±0．01 g，梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司）；BX53型5人共攬顯微鏡（精度為HE×100，奧林巴斯公司）；數碼相機（精度為1．2萬像素，奧林巴斯公司）；UNICEL DXC800型Synchron Clinnical System自動生化分析儀（誤差范圍為±1%，美國貝克曼庫爾特公司）；CELLDYN3700型自動血液分析儀（誤差范圍為±1%，美國雅培公司）；KDC-2046型低速冷凍離心機（轉速為3 000 r/min，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；EXCEL SIOR ES型、CS-VⅠ型包埋攤片烤片機（誤差范圍為±1%，孝感市宏業醫用儀器有限公司）；LEICA RM2245型旋轉石蠟切片機（垂直行程1～70 mm，徠卡顯微系統上海貿易有限公司）；LEICA ASP300S型脫水機（Thermo科學儀器有限公司）。

試藥：車前草（產地為江蘇，批號為15031301），白茅根（產地為安徽，批號為150801），鬼針草（產地為吉林，批號為15090502），均購自福建承創堂中藥有限公司，經福建中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室主任楊成梓教授鑒定為車前科植物車前 Plantago asiatica L．的干燥全草、禾本科植物白茅 Imperata cylindrica Beauv.var.major(Nees)C．E．Hubb．的干燥根莖及菊科 Compositae管狀花亞科鬼針草屬 Bidens L．的干燥全草。10%中性緩沖福爾馬林固定液-即用型（廣州維格斯生物科技有限公司，批號為17090104，規格為10%）；硫酸慶大霉素注射液（福州海王福藥制藥有限公司，批號為1709082，規格為每支8萬U∶2 mL）；重組人促紅素注射液（哈藥集團生物工程有限公司，批號為201706022，規格為每支3 000 U）；10%水合氯醛，AR級，由福建中醫藥研究院醫學比較中心實驗部提供；雙抗夾心法酶聯免疫吸附（ELISA）試驗試劑盒由Boheringer公司提供；復方三草滴丸由課題組前期制備。

動物與分組：SD大鼠60只，健康清潔級，雄性，周齡4 ～6 周，體質量（173．01 ±19．76）g，購于福建中醫藥研究院醫學比較中心實驗部，動物許可證號SCXK<閩>2016-0002。飼養條件為分籠飼養，給予標準飼料，自來水自由攝取，定期更換墊料，室溫約為20℃，相對濕度為56%，照明12 h暗12 h。60只大鼠適應性飼養3 d，隨機分為空白組、模型對照組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，各10只。本研究符合動物實驗倫理學原則。

1.2 處理方法

空白組皮下注射 2．5 mL/（kg·d）生理鹽水，其他各組均連續15 d皮下注射慶大霉素10萬U/（kg·d）造模[11]。各組于造模開始灌胃，高、中、低劑量組分別給予復方三草滴丸，分別按 25，12．5，6．25 g/（kg·d）灌胃1 mL；空白組和模型對照組灌胃生理鹽水10mL/（kg·d）；陽性對照組按3．5 μg/kg皮下注射促紅細胞生成素（EPO）1 mL，每周 3 次。EPO 配制：1 支 （3 000 U）EPO加注射用水 857 mL，即配成質量濃度為 3．5 μg/kg，按0．1 mL/100 g體質量皮下注射，隔天1次，每周3次。期間，大鼠每周稱體質量2次，以調整給藥劑量。30 d后，用水合氯醛麻醉后摘眼球，取血，斷頸處死，剖腹，取出腎臟，固定，選材，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，觀片。對取出的全血和血清樣品進行各項生化指標檢測。另外，高劑量組中1只大鼠在灌胃后死亡，從空白組中抽調1只至高劑量組；造模時模型對照組死亡2只，從空白組中抽調1只至模型對照組；造模時陽性對照組死亡1只，余9只；低劑量組死亡1只，余9只。

1.3 觀察指標

血液和生化指標：腎性貧血大鼠血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）含量測定用上述自動生化分析儀測定，外周血紅細胞（RBC）和血紅蛋白（Hb）用上述五分類血液分析儀進行測定，EPO含量檢測用ELISA試劑盒按操作步驟進行檢測。

腎組織病理學觀察：肉眼觀察腎臟大小、顏色等，部分組織置于福爾馬林-即用型固定液，固定約12 h，選材，脫水，按程序進行約13 h的脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅常規染色。在顯微鏡下觀察腎小管、腎小球的變化。

1.4 統計學處理[12-13]

采用SPSS 21．0統計學軟件分析。實驗檢測所得數據以±s表示，兩組間均數比較行 t檢驗；各組間均數比較采用ANOVA分析，行SNK法檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

大劑量皮下注射慶大霉素造模能引起大鼠腎功能快速衰竭。1周后，與空白組比較，模型對照組大鼠活動明顯減少，精神變差，進食量減少，尿量增加，體毛干枯、無光澤，體質量下降。陽性對照組和高、中、低劑量組大鼠精神、活動均較模型對照組明顯增強，體質量下降不太明顯。經過30 d，因大鼠生長代謝快，修復能力強，造模后2周體質量逐漸恢復，給藥后大鼠體質量均比給藥前重，其中陽性對照組、高劑量組、中劑量組增幅較大，符合實驗預期目標。詳見表1。

表1 各組大鼠體質量變化比較（±s，g）

表1 各組大鼠體質量變化比較（±s，g）

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2.2 血清BUN和SCr檢測

造模后，大鼠血清BUN和SCr均有一定變化，BUN較空白組，大部分差異有統計學意義（P＜0．01）。模型對照組BUN比空白組略降低，考慮造模后2周模型對照組大鼠新陳代謝快，體內腎損害修復功能強，或許是個體差異的原因等；陽性對照組和高、中、低劑量組大鼠BUN均明顯降低（P＜0．01）。與空白組相比，模型對照組SCr略高，陽性對照組和高、中、低劑量組大鼠均明顯降低，組間比較無顯著差異（P＜0．05），但實驗結果和預期大體一致，詳見表2。方差分析見表3。

表2 各組大鼠血清BUN和SCr水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清BUN和SCr水平比較（±s）

注：與低劑量組相比，aP＜0．01；與模型對照組相比，bP＜0．01；與高劑量組相比，cP＜0．01；與空白組相比，dP＜0．01。

組別空白組（n=8）模型對照組（n=9）陽性對照組（n=9）高劑量組（n=10）中劑量組（n=10）低劑量組（n=9）BUN（mmol/L）7．99 ±1．66ac37．08 ±3．56 7．79 ± 1．62ac37．51 ±5．23 6．93 ± 0．7234．31 ±4．03 6．30 ± 1．07bd34．56 ±3．46 6．98 ± 1．0834．60 ±6．16 6．33 ± 1．89bd33．82 ±5．90 SCr（μmol/L）

表3 各組大鼠單因素方差分析

2.3 RBC,Hb,EPO檢測

造模后，對照組動物的RBC，Hb，EPO均有一定變化，RBC及Hb較空白組差異有統計學意義（P＜0．05）。與空白組相比，模型對照組RBC及Hb略降低，陽性對照組和高、中、低劑量組均提升（P＜0．05）。模型對照組EPO比空白組略降低，陽性對照組和高、中、低劑量組EPO均提升，組間比較無顯著差異（P＜0．05），但實驗結果和預期大體一致，詳見表4。方差分析見表3。

表4 各組大鼠全血RBC計數及Hb和EPO含量比較（±s）

表4 各組大鼠全血RBC計數及Hb和EPO含量比較（±s）

注：與空白組相比，iP＜0．01；與模型對照組相比，fP＜0．05；與高劑量組相比，jP＜0．05；與中劑量組相比，hP＜0．05；與低劑量組相比，eP＜0．05；與空白組相比，lP＜0．05。

組別空白組（n=8）模型對照組（n=9）陽性對照組（n=9）高劑量組（n=10）中劑量組（n=10）低劑量組（n=9）RBC（×1012/L）0．40 ± 0．466egh147．80 ± 6．15e3．20 ± 0．42 6．34 ± 0．449egh147．20 ± 13．7e3．13 ± 0．45 6．77 ± 0．457156．00 ± 6．983．36 ± 0．33 6．97 ± 0．371fi152．90 ± 5．953．39 ± 0．33 6．91 ± 0．411fi153．40 ± 9．663．27 ± 0．24 6．99 ± 0．525fi159．00 ± 12．19fl3．25 ± 0．10 Hb（g/L）EPO（μg/L）

2.4 腎組織病理切片

按1．3項下要求觀察大鼠腎組織病理，結果描述詳見表5和圖1。

表5 光鏡下各組大鼠腎組織病理切片觀察指標

圖1 各組大鼠腎組織病理切片（HE×100）

3 討論

3.1 造模藥物選擇

原本設計采用抗毒蛇血清造模，效果應該比較明顯，但考慮到抗蛇毒血清是液體制劑，使用前要進行皮試防過敏休克等反應，且不同種類蛇的血清價格不一，在一般藥店和醫院不容易購買，普及性不大。慶大霉素屬氨基苷類抗生素，其腎臟毒性作用機制，可能為通過使組織氧化活性產物增加而引起的腎組織損害，大劑量應用能引起人和實驗動物腎功能衰竭[14-16]。這種損害的程度和腎臟組織攝入慶大霉素的速度和量有直接關系，慶大霉素對腎臟組織和腎功能的影響具有“時間早、程度重”的特點。且組織學研究證實，慶大霉素可造成近曲小管壞死、髓質內管型形成等病理變化。故采用慶大霉素皮下注射大鼠，可模擬人慢性腎功能不全的病程和特點，并表現出慢性腎功能衰竭伴發貧血癥狀特征，是研究腎性貧血的較好模型[7]。由表2和表4可知，注射慶大霉素后的大鼠出現血清BUN和SCr，外周血RBC，Hb，EPO較明顯改變，雖然指標均在正常范圍內（文獻報道大鼠 BUN 為 6．43～8．21 mmol/L，SCr為 29．17 ～ 53．93 μmol/L[17]），但實驗結果與實驗預期基本一致，說明造模方法可靠。不同劑量的復方三草滴丸對腎性貧血均有一定的防治作用，大鼠SCr下降，BUN降低，外周血RBC，Hb，EPO升高，減輕腎臟壞死和炎性浸潤，其中高、中劑量組對腎性貧血的血紅蛋白和腎功能的恢復效果較好。

3.2 陽性實驗藥物選擇

實驗結果表明，BUN和SCr是目前臨床判定腎功能常用且可靠的指標，SCr是全身肌肉的代謝產物，影響因素最小，反映腎小球濾過率，BUN在排除高蛋白飲食和上消化道出血后，其絕對值的高低與臨床癥狀呈正相關；血清SCr和BUN的降低說明復方三草滴丸能加速大鼠體內氮類代謝產物的排泄，減輕氮質血癥，改善腎小球濾過率的作用，可能與復方三草滴丸中主藥鬼針草的清熱解毒、散瘀消腫功效相關。慢性腎功能衰竭時的貧血屬于慢性病貧血，同時也多繼發于腎病的各種癥狀。李蓉生[18]認為，腎病、腎功能衰竭是貧血的基礎，改善腎功能是治療的關鍵。EPO是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質，能促進RBC生成，腎病過程中腎單位進行性下降，影響EPO生成是腎性貧血的重要發病機制之一。本研究中采用重組人促紅素注射液作為陽性實驗藥物也有一定依據。雖然實驗結果顯示EPO作為陽性對照效果指標不是很明顯。依據文獻[19]，采用生血寧片、金水寶膠囊作陽性對照品也有一定依據，往后的研究可以考慮進行比較實驗。

本研究尚未涉及的有關復方三草滴丸的藥效學研究，還需今后進一步探索。復方三草滴丸臨床主要用于蛇毒咬傷等保護腎功能及減少腎損害，通過改善腎功能，同時促進EPO生成并改善貧血，且該滴丸的藥材廉價、易得。一旦劑型改造成功且穩定有效，則應用方便，值得進一步開發。