抗腫瘤新藥乙烷硒啉對人舌鱗狀細胞癌細胞增殖和遷移的影響

邢 龍 李 楊 馬小龍 MOHAMMED H 黃 瑩 謝富強 * 馮正虎

（1．西北民族大學口腔醫學國家民委重點實驗室，甘肅 蘭 州 730030；2．西北民族大學甘肅省口腔疾病研究重點實驗室/培育基地，甘肅蘭州 730030；3．蘭州大學口腔醫學院，甘肅蘭州 730000；4．蘭州大學第二醫院，甘肅蘭州 730030）

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是頭頸部高發的惡性腫瘤之一，具有男性、年齡大者高發的特征，全世界每年新發約300萬例，5年生存率低于50%，煙酒是其主要危險因素[1-3]。目前，癌癥的治療方法以包括手術、放射和化學治療的綜合治療為主，手術仍是TSCC治療的基礎，輔助個性化放療方案和多種化療藥物的聯合治療方案，能夠改善患者的生活質量，延長生命[4]。

新型有機硒化合物乙烷硒啉(BBSKE)是由北京大學藥學院研發的國家一類抗腫瘤新藥，目前正處于臨床Ⅰ期研究，其藥物作用靶點為硫氧還蛋白還原酶[5]。目前，相關研究結果顯示硫氧還蛋白及其還原酶與多種腫瘤的發生與進展有關，并且在舌鱗狀細胞癌組織中呈現過表達[6]。乙烷硒啉在對腫瘤有明顯生長抑制作用的同時，能夠增強放射治療的敏感性，聯合用藥可降低耐藥性、提高藥效[7-8]。本文將乙烷硒啉體外作用于舌鱗狀細胞癌CAL27細胞系，觀察其抗腫瘤細胞生長的效果，并探討其可能的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔舌鱗狀細胞癌CAL27細胞系受贈于上海市口腔醫學重點實驗室；乙烷硒啉粉劑購于北京大學藥學院；DMEM高糖型培養基購于Gibco公司；胎牛血清購于BI公司；胰蛋白酶購于Sigma公司；四甲基噻唑藍(MTT)試劑、青鏈霉素混合液和結晶紫粉劑均購于Solarbio公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購于BD公司；Hoechst 33258染色液購于MCE公司；Transwell小室購于Contar公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 將BBSKE粉劑溶于DMSO，配制成20 mmol/L母液，用含有10%血清的培養基稀釋成相應濃度藥物(含1‰ DMSO)，以培養基含有1‰ DMSO和10%血清的細胞為溶劑對照組，以培養基只含10%血清的細胞為正常對照組。

1.2.2 細胞培養 人舌鱗癌CAL27細胞常規培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。每日觀察細胞形態、數目、培養基的顏色和透明度，1～2 d更換一次培養基。待細胞生長至匯合度為70%～80%時傳代。傳代前用0.25%的胰蛋白酶消化，至細胞變圓變小后，傾去胰蛋白酶，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基終止消化，輕輕吹打細胞制成單細胞懸液，分瓶后重新置于原培養箱中繼續培養。采用對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.3 MTT檢測CAL27細胞增殖活力 取濃度為5×104/mL的對數生長期CAL27細胞，接種于96孔板，每孔加100 μL細胞懸液，孵育過夜。實驗組分別加入2、5、10、20 μmmol/L的BBSKE，各組分別培養24、48、72 h，終止培養后PBS清洗一遍，加入含有10%血清的培養基100 μL，每孔加10 μL MTT，繼續培養4 h，吸取孔內液體，每孔加100 μL DMSO，置搖床低速振蕩10 min，在酶標儀上測定吸光度D(490)值。增殖抑制率=[D(490)對照組- D(490)實驗組] /[D(490)對照組- D(490)空白組]×100%。依據測算的抑制率，應用SPSS軟件Probit回歸分析計算各時間點的IC50值。

1.2.4 流式細胞術檢測CAL27細胞凋亡率 收集濃度為2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用24 h的CAL27細胞以及對照組細胞，PBS重懸，細胞終濃度至少為1.0×106/mL，離心后加入緩沖液(1×)重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC標記，室溫避光孵育15 min，上機前加入5 μL PI，1 h內檢測。實驗結果判定：無染色細胞為存活細胞(左下象限)，Annexin V單染細胞為早期凋亡細胞(右上象限)，AnnexinV、PI雙染細胞為晚期凋亡或壞死細胞(右下象限)，PI單染細胞為機械性損傷細胞(實驗操作過程誤差，左上象限)，流式細胞儀計量測得各象限細胞比率，以-x±s表示。

1.2.5 CAL27細胞周期檢測 收集經2、5、10、20 μmol/L BBSKE作用24 h后的CAL27細胞和對照組細胞，置離心管，PBS重懸細胞，細胞終濃度至少為1.0×106/mL，離心后加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化乙錠(PI)，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min后上機檢測，單次獨立實驗重復3次，應用Flowjo 7.6.1分析各濃度細胞周期比率，以x-±s表示。

1.2.6 Hoechst 33258免疫熒光染色檢測CAL27細胞凋亡 取5.0×105/mL的CAL27細胞接種于6孔板內，待貼壁后分別加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用12 h，對照組不作處理，作用后棄培養液，4%多聚甲醛4℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸盡固定液，加入10倍稀釋的Hoechst 33258染色液室溫孵育10 min，PBS洗2次，超凈臺中避光風干，封片后，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Transwell小室CAL27細胞遷移實驗 取5.0×105/mL的無血清CAL27細胞懸液接種于Transwell小室內，下室分別加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE，對照組下室加入含10%血清的培養基，上下室內培養12 h，用棉簽棒擦盡上室殘余細胞，下室用4%多聚甲醛4 ℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸盡固定液，加入結晶紫染色液室溫孵育10 min，PBS洗2次，超凈臺中避光風干，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個樣本隨機采集5張圖片，計數遷移細胞。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以x-±s 表 示。各藥物濃度處理組與正常對照組指標差異的分析采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 MTT實驗分析不同濃度BBSKE對CAL27細胞系增殖抑制率的影響

MTT實驗結果見表1，CAL27細胞在各作用時間隨藥物濃度的增加，其腫瘤細胞增殖抑制率逐漸增加；在同一濃度的BBSKE作用下，抑制率隨作用時間的增加而增加。BBSKE作用24、48、72 h對CAL27細胞系增殖抑制的IC50分別為(48.0±2.2)、(13.8±1.4)、(3.2±0.6) μmol/L。

表1 不同濃度BBSKE作用不同時間后對CAL27細胞增殖抑制率的影響-(%，x±s)

2.2 不同濃度BBSKE對CAL27細胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術實驗結果見圖1和表2，可見與對照組比較，隨著BBSKE藥物濃度的增加，CAL27細胞凋亡的比例隨之增加。濃度為5、10、20 μmol/L的BBSKE處理后的早期凋亡率明顯增加(P＜0.01)，濃度為10、20 μmol/L的BBSKE處理后的晚期凋亡率明顯高于對照組(P＜0.01)。

表2 不同濃度BBSKE對CAL27細胞凋亡率的影響(%，-x±s)

圖1 不同濃度BBSKE對CAL27細胞凋亡的影響

2.3 不同濃度BBSKE對CAL27細胞凋亡形態的影響

通過免疫熒光染色檢測不同濃度BBSKE作用后的CAL27細胞凋亡形態變化，實驗結果見圖2，可見2 μmol/L組細胞鏡下與對照組無明顯差異，未見細胞凋亡改變；5、10 μmol/L組相比對照組細胞形態出現明顯的細胞質固縮，染色質濃縮成半月狀附著于核膜，鏡下可見凋亡小體；20 μmol/L組則細胞數較少，見整個凋亡細胞濃染。

圖2 不同濃度BBSKE對CAL27細胞凋亡形態的影響

2.4 不同濃度BBSKE對細胞系CAL27細胞周期的影響

采用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術分析不同濃度BBSKE作用24 h后的CAL27細胞，結果見圖3和圖4，可見濃度為10和20 μmol/L時G2/M期比例明顯升高，與對照組相比存在顯著差異(P＜0.01)，出現G2/M期阻滯。

2.5 不同濃度BBSKE對細胞系CAL27細胞遷移的影響

結果見圖5和圖6，我們發現隨著BBSKE濃度的增加，穿過膜進入下室的細胞數逐漸減少，這說明BBSKE對人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞遷移有明顯的抑制作用。

3 討論

口腔癌中，針對舌鱗狀細胞癌的各種治療手段均存在并發癥風險，諸如手術治療后患者出現舌功能障礙，放化療導致骨髓移植、黏膜炎、脫發等影響患者的生存率和生活質量[9]。近些年靶向治療被認為是治療癌癥的新策略，一些前沿技術的研究如伽馬刀射線、基因治療、靶向細菌療法能夠獲得較好的治療效果[10-12]，同時將酶作為重要的藥物作用靶點，誘導癌細胞凋亡也是抗癌藥物研發的主要途徑之一。乙烷硒啉靶向硫氧還蛋白還原酶有著良好的抗腫瘤作用，但目前對于口腔癌的研究仍不多，我們將BBSKE作用于人舌癌CAL27細胞，觀察到CAL27細胞藥物作用后的細胞增殖被抑制，Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術、免疫熒光技術等也顯示細胞周期的改變和細胞凋亡。

圖3 不同濃度BBSKE作用于CAL27細胞24 h后對細胞周期的影響

圖4 不同濃度BBSKE對CAL27細胞周期的影響

我們的研究通過體外培養人舌鱗狀細胞癌CAL27細胞系，初次將不同濃度的BBSKE作用于人舌癌CAL27細胞，觀察該藥物對腫瘤細胞生長活性的影響，實驗結果顯示：CAL27細胞在各作用時間隨藥物濃度的增加，其腫瘤細胞生長抑制率逐漸增加；在同一濃度BBSKE作用下，抑制率隨時間增加，具有劑量依賴性和時間依賴性。Xing等[13]之前的研究將乙烷硒啉體內和體外作用對舌癌Tca8113細胞系，能夠顯著降低TrxR的表達活性，促進凋亡信號因子Caspase-3的表達升高，抑制腫瘤細胞生長。這些研究結果均提示BBSKE在用于治療人舌鱗狀細胞癌方面具有潛在能力。

圖5 光學顯微鏡下觀察不同濃度BBSKE對CAL27細胞系細胞遷移的影響

-圖6 不同濃度BBSKE作用CAL27細胞后的細胞遷移數量(x±s)

細胞周期調控與腫瘤轉化在抗癌機制研究中扮演重要角色，細胞周期調控紊亂是腫瘤發生和腫瘤失控性增殖的誘發因素，這個過程是由于一些例如p53抑癌基因失活導致細胞周期監察點功能缺陷，引發各種錯誤進入周期，如損傷的DNA進入細胞周期，產生基因突變等的基因不穩定現象，使細胞周期驅動機制強化[14]。細胞凋亡是一個受復雜調控的程序性細胞死亡過程，是包含細胞正常更新、免疫系統發育和功能、激素依賴性萎縮、胚胎發育和化學誘導的細胞死亡的重要組成[15-16]。細胞周期和細胞凋亡，其各自傳導過程中的信號因子在兩個過程中都起著重要作用，細胞凋亡可發生于細胞周期的各個階段，細胞周期調控成分的突變可導致細胞凋亡或細胞增殖失控，這取決于誘導藥物和細胞的類型，例如抗癌藥物紫杉醇使人唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細胞周期阻滯于G2/M期，從而誘導細胞凋亡[17-18]。本課題組使用Annexin VFITC/PI染色流式細胞術檢測BBSKE對人舌癌CAL27細胞周期的結果發現G0/G1期比例在濃度為5、10、20 μmol/L的BBSKE作用后降低，G2/M則隨濃度的增加比例逐漸升高，細胞周期阻滯于G2/M期(見圖4、圖5)。在 BBSKE濃 度 為 5、 10、 20 μmol/L時 Annexin VFITC/PI染色流式細胞術和免疫熒光染色結果可見CAL27細胞形態改變、細胞核染色質固縮濃染，出現凋亡改變(見圖2、圖3)；同時，隨著濃度的增加凋亡細胞數明顯增加，與對照組相比存在顯著差異(P＜0.01)。Shi等[20]將BBSKE作用于前列腺癌細胞后能夠明顯抑制其生長，同時出現細胞周期阻滯于S期和細胞凋亡[19]。 Fu等[20]體外細胞實驗將BBSKE單獨或聯合順鉑作用于人結腸癌LoVo細胞，發現其單獨作用可將細胞周期阻滯于G0/G1期，聯合順鉑可以逆轉順鉑誘導的G2/M期阻滯，從而降低順鉑的耐藥性，提高藥效。本實驗MTT實驗結果測得各時間的半數抑制濃度(IC50) 隨著BBSKE作用時間增加，其IC50逐漸減小，這表明BBSKE隨作用時間的增加，其誘導細胞凋亡的能力越強(見表2)。我們的實驗結果及上述相關研究結果表明，乙烷硒啉能夠通過某些機制調控細胞周期，誘導不同周期階段的阻滯，從而誘導或促進細胞凋亡，達到癌癥治療的目的，同時聯合其他抗癌藥物的藥效更佳。

單細胞的遷移實驗是體外研究細胞運動的最佳方法，能夠為體內許多生理運動過程的研究提供依據，例如腫瘤轉移的評估[21-22]。Transwell小室細胞遷移實驗是衡量細胞遷移能力較好的實驗方法，在不同濃度BBSKE作用下，CAL27細胞的遷移數量與藥物濃度呈反比(見圖7)，該結果說明BBSKE能夠影響CAL27 細胞遷移能力，抑制TSCC腫瘤轉移。

根據以上結果表明，BBSKE對TSCC具有較好的抗腫瘤作用，其抗腫瘤的機制可能為通過某些信號因子將腫瘤細胞周期阻滯于G2/M期，從而誘導或促進細胞凋亡，使癌細胞死亡；同時，BBSKE具有抑制癌細胞轉移的作用，降低癌癥復發率。相似的研究僅對BBSKE誘導細胞凋亡的作用機制，通過凋亡信號因子的傳導進行研究，本文首次從體外分析了BBSKE對人舌癌細胞周期和細胞遷移的影響，結果提示其抗腫瘤的潛在機制可能與細胞周期相關蛋白存在相關性，其具體的信號傳導機制尚需進一步實驗研究。因此，新型有機硒化合物乙烷硒啉能夠作為TSCC患者化療治療的備選藥物，本研究為其臨床應用提供了實驗依據。