細(xì)顆粒物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

吳德生王宏輝袁建輝 2*王宏菊趙瓊輝劉建軍

（1．深圳市疾病預(yù)防控制中心毒理研究所，現(xiàn)代毒理學(xué)重點實驗室，廣東 深 圳 518055；2．深圳市南山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東深圳 518054；3．深圳市出入境檢驗檢疫局，廣東 深 圳 518045）

細(xì)顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是空氣動力學(xué)直徑小于2.5 μm的顆粒，其粒徑小，比表面積大，易于富集空氣中的有毒有害物質(zhì)，并可以隨著人的呼吸進入體內(nèi)，甚至進入人體肺泡或血液循環(huán)系統(tǒng)，直接導(dǎo)致心血管、呼吸系統(tǒng)等疾病，是大氣環(huán)境中化學(xué)組成成分最復(fù)雜、危害最大的污染物之一[1-2]。當(dāng)前，PM2.5污染已成為突出的大氣環(huán)境問題，引起全世界各國的廣泛關(guān)注。

長期處在霧霾天氣中，人體吸入越來越多顆粒物，附于其上的有毒有害物質(zhì)不斷地隨著血液進入人體，會對雌性或雄性的性腺產(chǎn)生直接或間接的毒性效應(yīng)，人群中不育、性功能異常、月經(jīng)周期紊亂等生殖功能發(fā)生異常的壓力也隨之增加[3-4]。然而，目前我們對霧霾細(xì)顆粒物對胚胎發(fā)育的危害作用及其機制并不十分清楚。因此，本文以模式生物斑馬魚胚胎為研究模型，探討霧霾細(xì)顆粒物對胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

TH-1000 CII智能大容量空氣細(xì)顆粒物(PM2.5)無碳刷采樣器，購于武漢天虹儀表有限責(zé)任公司；石英濾膜購于美國Whatman公司；斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)購于北京愛生科技發(fā)展有限公司，HF212uv CO2培養(yǎng)箱購于上海力新儀器有限公司，體式顯微鏡購自德國Leica顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司。

1.2 斑馬魚

AB系斑馬魚，由深圳市疾病預(yù)防控制中心現(xiàn)代毒理學(xué)實驗室自有AB系種魚繁殖提供。飼養(yǎng)于斑馬魚飼養(yǎng)系統(tǒng)，光照周期14 h/10 h明暗交替，每天投食1次，挑選體長(3±1) cm的成年、健壯斑馬魚進行實驗。

1.3 斑馬魚胚胎收集

選擇發(fā)育良好的5月齡性成熟斑馬魚18尾。雌雄各9尾分別放入3個交配盒，每盒雌雄各3尾，雌魚和雄魚分別置于交配盒隔離板兩側(cè)。隔離過夜后，給予光照刺激產(chǎn)卵，同時撤去隔離板，10～30 min后，將成魚轉(zhuǎn)移回飼養(yǎng)系統(tǒng)，收集交配盒底部胚胎，于培養(yǎng)箱中備用。

1.4 PM2.5樣品采集

選擇霧霾天氣進行采樣，采樣點位于深圳市某小學(xué)樓頂無遮擋區(qū)域，用細(xì)顆粒物采樣器采集大氣細(xì)顆粒物。采樣時間為24 h ，連續(xù)7 d ，采樣體積為1.3 m3/min。

1.5 PM2.5樣品前處理

將載有顆粒物的濾膜剪裁成2 cm×2 cm，浸入去離子蒸餾水中，超聲振蕩3 次，每次20 min，洗脫顆粒物。振蕩液經(jīng)6 層紗布過濾，濾液于4 ℃、14 000 r/min 離心30 min (半徑2.5 cm)，收集下層懸液冷凍真空干燥，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩ＥR用前用斑馬魚飼養(yǎng)用水配制成相應(yīng)濃度，振蕩使顆粒物充分混勻。

1.6 斑馬魚胚胎PM2.5暴露

將收集到的240個受精后2 h 的斑馬魚胚胎隨機分為6組，每組40個，分別暴露于0、5、20、80、320、800 μg/mL的PM2.5混懸溶液中，混懸液隨濃度的增加而濁度增加，在暴露后2、4、6、8、16、24、48、72、96 h分別在體式顯微鏡下計數(shù)胚胎孵化和死亡情況。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果以x±s表示。實驗組與對照組間指標(biāo)差異采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析方法處理，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 霧霾細(xì)顆粒物對斑馬魚死亡率的影響

如圖1所示，與對照組相比，各劑量組在暴露后4 h開始出現(xiàn)胚胎死亡的現(xiàn)象，80、320、800 μg/mL劑量PM2.5混懸溶液組胚胎在暴露后48 h開始出現(xiàn)大量的死亡，320、800 μg/mL組死亡率達到100%。經(jīng)過統(tǒng)計分析，PM2.5對斑馬魚胚胎的半數(shù)致死量為(56.6±2.8)μg/mL。

圖1 霧霾細(xì)顆粒物對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

2.2 霧霾細(xì)顆粒物對斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖2所示，與對照組相比，斑馬魚胚胎在霧霾細(xì)顆粒物暴露48 h后，隨著劑量的升高，胚胎孵化率逐漸降低。暴露72 h后，只有對照組孵化率達到100%，而800 μg/mL劑量組無一粒胚胎孵化。

圖2 霧霾細(xì)顆粒物對斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖3所示，斑馬魚胚胎通常于受精后48 h左右開始孵化，隨著細(xì)顆粒物暴露的濃度增加，胚胎出現(xiàn)不能孵化或者死胎現(xiàn)象也隨之增高，其中80 μg/mL組有較多胚胎出現(xiàn)了不出膜現(xiàn)象。

3 討論

圖3 細(xì)顆粒物暴露后斑馬魚胚胎的變化(×30)

2013年1月在霧霾污染最嚴(yán)重的京津冀區(qū)域共計發(fā)生5次強霾污染過程，整個1月份共計22 d PM2.5小時濃度超過國家擬于2016年實施的環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的二級標(biāo)準(zhǔn)(75 μg/m3)，其中PM2.5最高值一度達到680 μg/m3，遠高于“重度污染”的界限[5]。據(jù)遼寧省環(huán)保廳發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示[6]，2015年11月8日，沈陽市遭遇6級嚴(yán)重霧霾污染，全市PM2.5均值一度達到1 155 μg/m3，局地霧霾指數(shù)一度突破1 400 μg/m3，居當(dāng)日中國重點城市空氣污染首位。深圳市2014—2015年間，輕度污染發(fā)生天數(shù)占比19%。如此多發(fā)的霧霾天氣引發(fā)了民眾對健康的擔(dān)憂，尤其是霧霾對生殖健康的影響也成為民眾關(guān)注的焦點之一。

有研究發(fā)現(xiàn)。大氣PM2.5污染與人類生殖功能的改變顯著相關(guān)。Rogers等[7]的調(diào)查顯示極低體質(zhì)量兒與母親暴露于二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)和總懸顆粒物(total suspended particulate，TSP)的量存在明顯的相關(guān)性。Dugandzic等[8]發(fā)現(xiàn)空氣污染可能會增加新生兒低體質(zhì)量的風(fēng)險，這種影響以妊娠第1個月及最后兩周最明顯。PM2.5濃度與嬰兒低出生體質(zhì)量、宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)及先天性功能缺陷具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。BELL等[9]分析出生體質(zhì)量不足(低于2 500 g)的因素表明：孕期暴露于PM2.5中，其濃度每增加1個4分位差(2.2 g/m3)，嬰兒出生體質(zhì)量就下降14.7 g(95%CI：12.3～17.1 g)。出生體質(zhì)量不足與中期(14～26周)暴露于PM2.5有關(guān)。PM2.5對黑人母親后代的危險性大于白人母親的后代，顯示出明顯的種族效應(yīng)。Dejmek等[10]對PM2.5濃度較高的波希米亞褐煤盆地的一組孕婦進行研究發(fā)現(xiàn)，對于中等濃度的PM2.5暴露孕婦出現(xiàn)IUGR的OR值為1.26(0.81～1.95)，而高濃度(＞37 μg/m3)為2.11(1.20～3.70)，表明中、高濃度的細(xì)顆粒物污染可能會影響胚胎發(fā)育。

目前，有關(guān)PM2.5動物實驗的研究多集中于呼吸系統(tǒng)的危害，較少涉及生殖系統(tǒng)。本研究以斑馬魚為模式生物，研究PM2.5對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。正常情況下，斑馬魚胚胎在受精后48 h左右即可開始出膜孵化，以一定濃度PM2.5暴露于受精后的斑馬魚胚胎，其發(fā)育受到顯著的影響。本研究中，對照組48 h孵化率可達到72.5%±3.2%，PM2.5暴露組的孵化率則隨著PM2.5濃度的升高而降低，在各劑量組中可觀察到胚胎死亡現(xiàn)象。當(dāng)PM2.5暴露時間達到72和96 h后，對照組胚胎全部孵化，但在各暴露組中，不但有胚胎死亡現(xiàn)象，還有部分胚胎處于出膜前狀態(tài)，不能孵化。經(jīng)過相關(guān)回歸分析，PM2.5對斑馬魚胚胎的半數(shù)致死量為(56.6±2.8) μg/mL。胚胎死亡率、孵化率是觀察胚胎發(fā)育的重要指標(biāo)，本研究的結(jié)果顯示，PM2.5對斑馬魚的胚胎死亡率、孵化率均有影響。因此，PM2.5污染會導(dǎo)致胚胎發(fā)育受到影響。

霧霾已成為突出的大氣環(huán)境問題，引起全世界各國的廣泛關(guān)注。PM2.5會影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，造成胚胎死亡率增加，孵化率下降，因此，研究其毒性，探索其效應(yīng)機制已刻不容緩。