華蟾素對骨癌痛大鼠的鎮痛效應及對脊髓膠質細胞活化的影響

劉 丹 ，張 文，王心怡，陳 濤 ，胡 衛*

（三峽大學醫學院國家中醫藥管理局中藥藥理/腫瘤科研三級實驗室，湖北 宜 昌 443002）

骨癌痛(cancer-induced bone pain，CIBP)是一種特殊的慢性疼痛且隨著疾病的進展不斷增加，其產生是由原發性腫瘤細胞轉移至骨所致[1]。發生骨轉移的患者通常起初無明顯癥狀，直到出現骨的疼痛或者骨骼相關并發癥(如骨質破壞等)時才能被明確診斷，而在轉移晚期，這種疼痛很難治療，嚴重影響患者的生活質量[2]。因此，我們仍需進一步探索CIBP發生發展的機制，尋求新的止痛劑及治療方案。

中醫藥治療CIBP有肯定的療效，以其升高痛閾，降低機體對不良刺激反應程度，改變精神狀態來減輕痛苦，且使用安全、無成癮性和戒斷性，目前已經廣泛應用于CIBP的各個階段[3]。其中，我國傳統的名貴藥材——蟾蜍，具有解毒、消腫、止痛、抗炎抗腫瘤等功效，在臨床上應用非常廣泛，其全皮水提物華蟾素是我國自行研制的二類新藥[4]。課題組前期研究發現華蟾素可通過阿片受體與阿片肽結合后抑制神經遞質P物質(substance P，SP)和降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)的表達，減少疼痛的傳遞抑制癌痛的發生和發展[5]。另有研究發現華蟾素能使炎性疼痛模型大鼠的炎癥和疼痛明顯緩解且呈現一定的劑量依賴性，抑制炎癥介質的釋放發揮其抗炎鎮痛作用可能是其鎮痛的機制之一[6]。基于此，本實驗將進一步探討華蟾素是否能通過抑制CIBP大鼠脊髓膠質細胞的活化減少炎性介質釋放而發揮抗炎鎮痛作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實驗造模開始前進行大鼠機械痛與熱痛閾值的檢測，根據前期實驗及文獻核實，確定正常大鼠機械痛閾值范圍為26.0～32.0 g、熱痛閾值范圍14.0～19.2 s，根據這個范圍進行實驗大鼠篩選。測量的起始值都是從0開始，篩出SPF級雌性(本實驗選用的骨癌痛造模細胞是乳腺癌細胞，在雌性大鼠體內傳代，選用雌性大鼠造模更合理)SD大鼠48只，體質量160～180 g，由三峽大學醫學院實驗動物中心提供[實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2011-0012]。將大鼠隨機分為4組，正常對照組、假手術組、模型組和華蟾素(安徽金蟾生化股份有限公司，國藥準字Z34020274，規格為每支5 mL，貨號150723-25)干預組，每組12只，華蟾素干預組于造模第7天開始腹腔注射華蟾素注射液(5 mL/kg，每天1次，連續8 d)，其余各組每天予以等量生理鹽水。

1.2 骨癌痛模型制備

取雌性幼鼠2只，體質量60～80 g，腹腔注射乳腺癌Walker 256細胞0.5 mL(細胞濃度為4×107/mL)，接種第7天收集腹水，以無菌PBS(0.01 mol/L)漂洗細胞3次，細胞濃度調整至4×105/mL的濃度，置于冰上備用。模型組與華蟾素干預組大鼠麻醉后，仰臥固定于大鼠操作臺，備皮后碘伏消毒右側后肢脛骨處皮膚，于脛骨上段作l cm切口，暴露脛骨，在脛骨結節下0.5～l cm脛骨平臺上用1 mL注射器針頭垂直鉆孔至骨髓腔，待骨髓血液無明顯外流后，再用微量注射器將Walker 256細胞懸液0.01 mL緩慢注入骨髓腔，注射完畢后用醫用無菌骨蠟封住針孔，常規消毒傷口，局部給予少許青霉素后縫合傷口。假手術組操作與上述相同，用微量注射器注射0.01 mL PBS。

1.3 大鼠行為學檢測

分別于造模前、造模后第2、5、7、9、13、15天進行相關行為學(熱痛、機械痛)檢測。將大鼠置于底為網格的特制有機玻璃內，待大鼠安靜后，將von Frey 2391 探針分別刺激大鼠左右后足腳掌中部皮膚測定機械痛值，觀察大鼠縮足反應并記錄大鼠的機械性閾值；大鼠置于底為光滑玻璃的有機玻璃格子內，適應一段時間后采用輻射熱測痛儀測熱痛值，將強熱光束分別照射大鼠左右后足腳掌中心皮膚，引起大鼠縮爪反應時間為大鼠縮爪潛伏期，實驗光源強度設定為35%，為防止大鼠燙傷，將上限值定為20 s。每只大鼠每個行為學測定3次，前后兩次間隔10 min，取平均值。

1.4 X-ray評估骨質的破壞

在大鼠脛骨接種腫瘤細胞后，為了確定腫瘤生長對骨質的破壞，在造模后第7天將大鼠接種側和對照側后肢放在X光膠片(柯達公司，貨號XBT-1) 前，暴露在30 kVp強度的X射線下1 min，X光片在顯影劑(天津市漢中攝影材料廠，KonicaSRX-101)下顯影，進行X線檢測。

1.5 免疫組化檢測膠質細胞活化情況

實驗終末，大鼠麻醉后用多聚甲醛常規灌注固定，取L4～L6段脊髓，30%蔗糖脫水后，冰凍冠狀切片，收集切片于0.01 mol/L PBS中，每個脊髓標本分別選擇5張切片與小鼠膠質纖維酸性蛋白(glial filament acidic protein，GFAP)抗體(Abcam公司，1∶100稀釋)和兔小膠質細胞標記小鈣結合蛋白—鈣離子結合分子(ionized calcium-binding adaptor molecule，Iba-1)抗體(Abcam公司，1∶100稀釋)于4 ℃孵育12 h；依次加入生物素標記的二抗(HRP標記山羊抗兔/小鼠二抗)、親和素-生物素-過氧化物酶孵育后，以3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)呈色。顯色完成后將切片置于載玻片上，常規乙醇脫水，二甲苯透明，明膠封片，于光學顯微鏡下檢測膠質細胞的活化狀態。

1.6 酶聯免疫吸附試驗檢測相關炎性因子表達情況

實驗結束時麻醉大鼠，切開腹部，剝離腹主動脈，采血針取血4～5 mL，靜置2 h后離心，取血清；冰上取出L4～L6段脊髓，勻漿后離心取上清液。按酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明進行相關炎性因子(TNF-α和IL-1β)的檢測。

1.7 統計學處理

運用SPSS 19.0軟件包進行統計分析處理。采用方差分析進行數據檢驗(有重復測量資料方差分析、單因素方差分析)，兩組間的兩兩比較，方差齊時用LSD法；方差不齊時，用Dunnett T3法。

2 結果

2.1 大鼠脛骨的影像學變化

大鼠脛骨X-ray結果顯示，在造模后第7天，正常對照組大鼠的骨質完整，骨皮質呈連續狀，邊界光滑、清晰，骨髓腔內未見明顯異常(如圖1A)；假手術組骨質些許缺損，骨皮質呈連續狀，周圍骨組織未見明顯腫脹(如圖1B)；模型組大鼠明顯的骨質破壞，同時骨皮質有明顯的缺損，骨內結構不清晰，周圍骨組織明顯腫脹(如圖1C)。說明骨癌痛大鼠造模成功。

圖1 大鼠脛骨的影像學變化

2.2 華蟾素對骨癌痛大鼠行為學的影響

大鼠行為學檢測結果顯示，與正常對照組比較，假手術組大鼠熱痛閾值、機械痛閾值均無明顯變化，模型組大鼠的熱痛閾值與機械痛閾值均明顯降低，差異均具有顯著的統計學意義(P＜0.01)；與模型組相比，華蟾素干預后可顯著上調大鼠熱痛閾與機械痛閾值，差異均具有顯著的統計學意義(P＜0.01)，結果見圖2。

2.3 華蟾素對骨癌痛大鼠脊髓膠質細胞活化的影響

大鼠免疫組化結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓星形膠質細胞標記蛋白(GFAP)和小膠質細胞標記蛋白(Iba-1)含量均明顯增加，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)；與模型組相比，華蟾素干預組大鼠脊髓GFAP和Iba-1蛋白表達均降低，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)，結果見圖3。

2.4 華蟾素對骨癌痛大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表達的影響

ELISA檢測結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β表達均明顯上調，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)；與模型組相比，華蟾素干預組大鼠脊髓及血清中TNF-α和IL-1β濃度均降低，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)，結果見圖4。

圖2 華蟾素對骨癌痛大鼠行為學的影響

圖3 華蟾素對骨癌痛大鼠脊髓星形膠質細胞標記蛋白GFAP和小膠質細胞標記蛋白Iba-1表達的影響(×400)

圖4 華蟾素對骨癌痛大鼠脊髓及血清中相關炎性因子表達的影響

3 討論

CIBP是一種特殊的疼痛，與一般疼痛相似但又有其獨特的特征，主要包括腫瘤的生長破壞骨組織引起的機能減弱，此外，其同時包含炎性疼痛及神經病理性疼痛兩方面，被認為是治療最困難的疼痛之一，嚴重影響患者生活質量[7-8]。越來越多的研究發現中樞神經系統中的一些免疫功能細胞(主要是星形膠質細胞和小膠質細胞)在慢性疼痛形成的病理機制中占有重要地位[9-10]。在CIBP中，可以發現脊髓星形膠質細胞與小膠質細胞的激活，激活的膠質細胞主要是特定膠質細胞標記物的上調或形態的改變，包括肥大、增生等。小膠質細胞被激活后，Iba-1表達上調[11]；激活的星形膠質細胞會發生形態的改變(如細胞肥厚)、GFAP表達的增加，引起轉錄后的修飾，導致脊髓促炎物質，包括TNF-α、IL-1β、ROS、興奮性氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)，增加神經的興奮性，加重疼痛反應[12-13]。而在CIBP大鼠中予以膠質細胞抑制劑，可有效降低一些細胞因子(TNF-α、IL-1β等)的表達，減輕大鼠的機械痛和熱痛，可以緩解或阻斷疼痛的發生和發展[14]。

華蟾素及其原藥材蟾蜍皮具有解毒散結、消腫止痛的功效，亦有文獻記載其具有扶正補虛，強心定痛之功效。對于癌痛“邪毒於結、本虛標實”的病機特點，華蟾素既能清熱解毒、消腫散結以治其實，又能扶正以治其虛，因此控制癌痛方面表現出較好的療效。CIBP發病機制不同于單純的神經病理性疼痛或炎性痛，它是神經病理變化、炎性反應和組織壞死等因素的綜合結果，從功效上分析，華蟾素能治療CIBP一方面是因為其能清熱解毒以消炎止痛，另一方面與其消腫散結以控制腫瘤生長、減輕腫瘤周圍組織的腫脹壓迫而緩解神經病理性疼痛有關。本課題組前期研究發現華蟾素能增加背根神經節阿片受體表達發揮外周鎮痛，但其如何發揮消炎止痛的機制尚不清楚。為了進一步探討華蟾素抗炎鎮痛的機制，本實驗通過大鼠脛骨注射Walker 256細胞建立CIBP模型，造模后第7天脛骨X線顯示：模型組大鼠骨皮質破壞明顯、骨質連續性缺乏、骨組織腫脹明顯，對照組、假手術組未見明顯骨組織腫脹、骨連續性較好，說明CIBP模型成功。行為學檢測結果表明華蟾素可明顯緩解CIBP所誘發的機械痛敏、熱痛敏，而后的實驗結果發現，華蟾素可抑制CIBP大鼠脊髓星形膠質細胞、小膠質細胞的活化，減少脊髓膠質細胞相關炎性介質(TNF-α和IL-1β)的釋放，同時也可降低其釋放到血清中的TNF-α和IL-1β濃度。這些結果表明華蟾素對CIBP大鼠有較好的鎮痛效應，其機制之一可能是通過抑制脊髓星形膠質細胞及小膠質細胞活化、減輕炎癥反應發揮作用的。