淬滅胃癌SGC-7901細胞內活性氧對維生素E琥珀酸脂誘導內質網(wǎng)應激的影響

黃曉莉，吳 坤，趙莎莎

（1．山東大學齊魯醫(yī)院營養(yǎng)科，山東濟南250012；2．哈爾濱醫(yī)科大學營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，黑龍江 哈 爾濱 150081）

維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的第6位羥基被琥珀酸所替代，并脫去1個水分子形成的酯類化合物。體內外研究發(fā)現(xiàn)VES作為一種潛在的腫瘤化學預防和治療劑，能夠通過死亡受體介導的外源性途徑、線粒體介導的內源性途徑、MAPK、氧化應激等機制誘導不同腫瘤細胞發(fā)生凋亡[1-3]。近年來，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和內質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為關鍵的信號分子和信號途徑在抗腫瘤研究中越來越受到重視[4-5]。ERS發(fā)生時，細胞可通過啟動未折疊蛋白反應來提高自身的生存能力，但是若應激刺激過強或過久，未折疊蛋白反應反而會激活相應的凋亡機制，誘導細胞凋亡[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)VES能夠誘導胃癌SGC-7901細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應，并能夠增加SGC-7901細胞內ROS的含量[3，6-7]。本文擬探討VES處理人胃癌細胞后淬滅ROS對細胞內質網(wǎng)應激的影響，旨在深入闡明VES誘導人胃癌細胞凋亡過程中ROS與內質網(wǎng)應激的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

VES和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；葡萄糖調節(jié)蛋白78 (glucose regulative protein，GRP78)多克隆抗體和C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)單克隆抗體均購自Cell Signaling公司；β-actin購自Santa Cruz公司；逆轉錄-PCR試劑盒購自TaKaRa。

MCO-17A型CO培養(yǎng)箱購于Sanyo公司；AllegraTM

2 64R低溫高速離心機和DUR 640核酸蛋白分析儀均購于Beckman公司；C1Si型激光共聚焦顯微鏡購自上海衡橋儀器有限公司；FACScan (Becton Dickinson)型流式細胞儀購于貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；分子雜交箱購于Amersham Life Science；ChemilmagerTM4000數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)購于Alpha Innotech公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

人胃癌SGC-7901細胞購自北京腫瘤研究所，細胞在含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。VES溶于無水乙醇中，配制為10 mg/mL的儲備液，4 ℃避光保存。處理細胞時用2% RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成20 μg/mL，含有0.1%乙醇的RPMI- 1640培養(yǎng)液為溶劑對照，并設有VES處理組、NAC處理組和NAC+VES聯(lián)合處理組。

1.3 檢測細胞內ROS含量

不同濃度(1、5、10和20 mmol/L)NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理12 h，無血清培養(yǎng)液與2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2′，7′-dichlorodihydro-fluorescein diacetate， DCFH-DA) 以1∶ 1 000 比例混合，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L。緩慢沖洗細胞后，加入稀釋好的DCFH-DA溶液，37℃培養(yǎng)箱內孵育20 min，每隔5 min輕輕搖勻1次。PBS緩慢沖洗細胞3次后，激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度，發(fā)射波長為525 nm，激發(fā)波長為488 nm。DCFH-DA進入細胞后生成二氯二氫熒光素(dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，細胞內的ROS可以使無熒光的DCFH氧化生成有熒光的二氯熒光黃(diemorofluorescein，DCF)，激光共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光，ROS含量越高則熒光強度越強。另將20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理細胞12 h，經(jīng)DCFH-DA染色后，流式細胞術檢測細胞內ROS水平的變化，方法同上。

1.4 逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測mRNA表達

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理15 h后，收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄。引物序列：β-actin，上游5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3′，下游5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增產(chǎn)物為540 bp；GRP78，上游5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游5′-GTATCCTCTTCACCAGTTGG-3′，擴增產(chǎn)物為577 bp；CHOP，上游5′-GCACCT CCCAGAGCCCTCACTCTCC-3′，下游5′-GTCTACTCC AAGCCTTCCCCCTGCG-3′，擴增產(chǎn)物為422 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色、拍照，并進行灰度值分析。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理24 h后，收集細胞，用冷的PBS沖洗2次，懸浮于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，采用Bio-Rad DC Protein Assay測定上清液中蛋白質含量，等量蛋白上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，低溫轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h后，分別加入一抗和堿性磷酸酶標記的IgG二抗，孵育后加顯色底物，數(shù)字成像儀掃描成像，并進行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

每組實驗至少重復3次，采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。通過ANOVA方差分析進行組間比較，各組之間的兩兩比較采用LSD法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察胃癌SGC-7901細胞ROS水平

激光共聚焦顯微鏡觀察見圖1。結果表明，20 μg/mL VES使細胞內ROS含量明顯升高，而經(jīng)不同濃度NAC預處理之后，與單純VES處理組相比，10 mmol/L NAC預處理組細胞內ROS開始降低，20 mmol/LNAC預處理組降低最為明顯。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察SGC-7901細胞內ROS水平

2.2 流式細胞術檢測胃癌SGC-7901細胞內ROS水平

見圖2。結果表明，與對照組比較，20 μg/mL VES明顯促進細胞內ROS的生成，而20 mmol/L NAC預處理能明顯降低ROS的產(chǎn)生，與激光共聚焦顯微鏡檢測的結果一致，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均＜0.05)。

圖2 流式細胞術檢測SGC-7901細胞內ROS水平

2.3 淬滅細胞ROS對內質網(wǎng)應激相關分子GRP78和CHOP mRNA表達的影響

見圖3。結果表明，20 μg/mL VES能夠提高GRP78和CHOP mRNA水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對GRP78和CHOP mRNA表達的誘導作用。

2.4 淬滅細胞ROS對內質網(wǎng)應激相關分子GRP78和CHOP蛋白表達的影響

見圖4。結果表明，20 μg/mL VES能夠提高胃癌SGC-7901細胞內GRP78和CHOP蛋白水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對GRP78和CHOP蛋白表達的誘導作用。

3 討論

內質網(wǎng)作為真核細胞重要的亞細胞器，參與蛋白質的合成、加工、運輸及脂類的合成和儲存等重要生理功能。各種生理和病理刺激條件下，未折疊或折疊錯誤的蛋白積聚在內質網(wǎng)內，可誘發(fā)內質網(wǎng)應激反應。如果內質網(wǎng)應激反應損傷嚴重，則激活相應的凋亡機制，誘導細胞發(fā)生凋亡[5]。ROS產(chǎn)生增加或抗氧化防御系統(tǒng)受到損傷時，細胞處于氧化應激狀態(tài)，也可以引起細胞凋亡[4]。有研究發(fā)現(xiàn)內質網(wǎng)應激誘導糖尿病腎病小鼠管狀上皮細胞凋亡過程中，ROS發(fā)揮了非常重要的作用[8]。也有報道顯示亞硒酸鈉誘導人急性早幼粒細胞白血病NB4細胞和脫氫甲基還氧醌霉素誘導肝癌細胞發(fā)生的內質網(wǎng)應激是氧化應激的下游事件[9-10]。另有研究卻發(fā)現(xiàn)葡萄糖誘導的內質網(wǎng)應激并未依賴氧化應激，相關研究結論并不一致[11]。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VES能夠誘導胃癌SGC-7901細胞發(fā)生內質網(wǎng)應激和未折疊蛋白反應，并能夠增加SGC-7901細胞內ROS 的含量，本文則探討VES處理人胃癌細胞后淬滅ROS 對內質網(wǎng)應激的影響。

圖3 NAC對內質網(wǎng)應激相關分子mRNA表達的影響及灰度值分析

圖4 NAC對內質網(wǎng)應激相關分子蛋白表達的影響及灰度值分析

NAC作為一種巰醇化合物，是細胞內還原型谷胱甘肽的前體，可以促進谷胱甘肽合成，增強谷胱甘肽S轉移酶的活性，對氧自由基反應直接作用并促進解毒，是一種非常強的抗氧化劑，可以抑制細胞內ROS的產(chǎn)生[12]。本研究中20 μg/mL VES能夠顯著促進胃癌SGC-7901細胞內ROS的生成，20 mmol/L NAC預處理細胞2 h可以明顯抑制ROS的產(chǎn)生，驗證了NAC清除ROS的作用，并通過探討VES處理胃癌細胞后NAC對內質網(wǎng)應激的影響，進而闡明VES誘導人胃癌細胞凋亡過程中ROS與內質網(wǎng)應激的關系。

GRP78分布在內質網(wǎng)腔內，可識別錯誤折疊蛋白，協(xié)助蛋白質折疊、伸展、組裝和轉運，幫助未折疊蛋白定位于內質網(wǎng)腔，具有內質網(wǎng)標志性分子伴侶的功能[13]。CHOP是內質網(wǎng)應激特異性轉錄因子。在非應激狀態(tài)下，CHOP表達水平很低；發(fā)生內質網(wǎng)應激后，CHOP表達水平顯著增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)20 μg/mL VES能夠顯著誘導GRP78和CHOP mRNA 及蛋白的表達，與前期結果一致。而通過NAC淬滅胃癌SGC-7901細胞內ROS后，20 μg/mL VES對GRP78和CHOP mRNA及蛋白表達的促進作用均被顯著抑制。因為GRP78和CHOP都是內質網(wǎng)應激非常特異的信號分子，所以本研究結果提示VES誘導的內質網(wǎng)應激可能依賴于ROS的生成。Kadara等[15]同樣發(fā)現(xiàn)，維胺脂引起人頭頸癌細胞ROS的形成可以引起內質網(wǎng)應激反應。還有研究發(fā)現(xiàn)維生素C和NAC等抗氧化劑能夠抑制牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)引起的腎近端小管上皮細胞GRP78水平上升[16]。同樣也有與本研究結果不同的報道。抗氧化劑維生素C和維生素E并不能逆轉高濃度葡萄糖作用人臍帶上皮細胞引起的內質網(wǎng)應激[17]。本研究僅初步探討VES作用胃癌細胞后淬滅活性氧對內質網(wǎng)應激的影響，詳細的機制仍需要進一步探討。