阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白引起HepG2肝細(xì)胞的基因表達(dá)變化

由淑萍 任立松 馬 龍 賀 筍陳澤良王 嶸 劉 濤*

（1．新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏 魯木齊 830032；3．中國(guó)解放軍69337部隊(duì)，新疆 額 敏 834601；4．新疆醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院，新疆 烏 魯木齊 830011）

自Franklin[1]首次分離并報(bào)道以來(lái)，阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii)已經(jīng)多次引起重大食品安全事件，造成嚴(yán)重的后果[2-3]。2007年新疆地區(qū)在進(jìn)出口食品中檢測(cè)并分離到阪崎腸桿菌[4]。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌新疆分離株經(jīng)酪蛋白氨基酸酵母浸膏培養(yǎng)液(casamino acid yeast extract medium，CAYE)培養(yǎng)后，其純化上清蛋白在一定條件下能夠?qū)θ槭蟾鹘M織器官產(chǎn)生損傷，尤其對(duì)肝組織損傷較為嚴(yán)重[5-7]，為進(jìn)一步探索該上清蛋白損傷肝組織的分子機(jī)制，本課題組純化阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白，將上清蛋白加入HepG2肝細(xì)胞培養(yǎng)液中，8 h后收集細(xì)胞并采用高通量測(cè)序法對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞基因進(jìn)行檢測(cè)，分析不同組中基因的差異表達(dá)、轉(zhuǎn)錄本水平定量分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，并對(duì)RPS18、RFC4基因進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞

阪崎腸桿菌新疆分離株IQCC10418，由中國(guó)檢驗(yàn)科學(xué)院趙貴明老師惠贈(zèng)，HepG2細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo公司；核酸分析儀購(gòu)于Biochrom公司；CAYE培養(yǎng)液購(gòu)于北京陸橋公司，配制按照Quintero-villegas等[8]提供的方法進(jìn)行，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)6孔板購(gòu)于Gibco公司，Trizol試劑購(gòu)于Qiagen公司，實(shí)時(shí)熒光定量?jī)xLight Cycler 2.0購(gòu)于美國(guó)Roche羅氏公司，BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Sangon Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌培養(yǎng)液上清蛋白純化 采用CAYE培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)阪崎腸桿菌；12 000 g、4 ℃離心CAYE培養(yǎng)液5 min；0.45 μm膜過(guò)濾上清，根據(jù)濾過(guò)后上清液的體積，按照1∶1比例加入飽合硫酸銨液并攪拌30 m in；12 0 00 g 、4 ℃ 再次進(jìn)行離心，取沉淀；磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)懸浮，4 ℃ 透析。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)純化產(chǎn)物中蛋白質(zhì)濃度，用蒸餾水稀釋為含蛋白濃度為1.6 μg/mL的水溶液。

1.3.3 感染HepG2肝細(xì)胞、提取總RNA 含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞呈單層致密狀時(shí)，常規(guī)胰蛋白酶消化傳代，24 h換液，72 h再傳代；實(shí)驗(yàn)調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度至1×106/mL，于6孔培養(yǎng)板中分別加入1 000 μL蒸餾水及1 000 μL純化產(chǎn)物稀釋液(終濃度為1.6 μg/mL)，建立對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔，8 h后，加胰酶回收；采用Trizol試劑盒提取總RNA；瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；并檢測(cè)RNA純度[D(260)/D (280)比值]。

1.3.4 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序 用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA，送Novogene公司illumina芯片測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，采用GoMiner數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Gene Ontology(GO)富集分析，采用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pathway分 析。

1.3.5 差異表達(dá)基因分析 采用DESeq2軟件統(tǒng)計(jì)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的cDNA文庫(kù)，RNA-seq測(cè)序技術(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，本實(shí)驗(yàn)中兩組間轉(zhuǎn)錄本的log2(Fold Change)絕對(duì)值大于1作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 由于高通量測(cè)試結(jié)果信息量巨大，只能提供初步篩選結(jié)果，不能十分準(zhǔn)確分析單個(gè)基因的狀態(tài)及表達(dá)情況。因此進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)驗(yàn)證十分必要。本次我們將選取log2(Fold Change)值為-1.10 且與核糖體密切相關(guān)、調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要作用的RPS18基因(ribosomal protein S18)和log2(Fold Change)值為2.13且與調(diào)控DNA復(fù)制與修復(fù)的功能分子RFC (replication factor C)亞基4進(jìn)行驗(yàn)證。β-actin為內(nèi)參基因。RPS18基因(引物序列5′-3′)：P1，tggatcactcggataaatgcggtaact；P2， tggatcactcggataaatgcggtaact(GenBank登 錄 號(hào)AY75781.1)。 RFC4基 因 ： P1， ggaactggaaaaacatcca ctattttg； P2， ctgagcagctgaggtcatagaatctgc(GenBank登 錄號(hào)CR536561.1)。反應(yīng)體系共20 μL，Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，模板 2 μL，純水7.2 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃、15 s，95 ℃、10 s，55℃、10 s，50個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果

瓊脂糖電泳結(jié)果表明，提取的RNA無(wú)DNA污染。經(jīng)檢測(cè)各組的D(260)/D(280)的值均在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 差異表達(dá)基因

經(jīng)高通量測(cè)序及基因差異表達(dá)結(jié)果分析表明，與對(duì)照組比較，共有5 120個(gè)差異表達(dá)基因，其中2 155個(gè)上調(diào)，2 965個(gè)下調(diào)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)為226個(gè)，占差異表達(dá)基因總數(shù)的4.41%，說(shuō)明差異表達(dá)基因中非編碼序列較少。表1為前5位表達(dá)上調(diào)的基因，表2為前5位表達(dá)下調(diào)的基因。

表1 前5位表達(dá)上調(diào)的基因

表2 前5位表達(dá)下調(diào)的基因

2.3 差異表達(dá)基因涉及到的信號(hào)通路

GO和KEGG pathway分析表明，經(jīng)上清蛋白作用后，基因差異表達(dá)涉及到219個(gè)信號(hào)通路，GO富集分析顯示，差異基因主要參與核分裂、有絲分裂、復(fù)制等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程(見(jiàn)圖1)。Pathway分析顯示，具有顯著富集的信號(hào)通路有5個(gè)，差異基因主要參與DNA的復(fù)制、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等(見(jiàn)表3)。

圖1 GO富集分析結(jié)果

表3 基因差異表達(dá)參與的信號(hào)通路

2.4 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

qPCR結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，可見(jiàn)選取的RPS18、RFC4 mRNA檢測(cè)結(jié)果與高通量測(cè)序的結(jié)果相同。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組RPS18 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，RFC4 mRNA表達(dá)則顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于阪崎腸桿菌的污染途徑、致病因子、致病機(jī)理等報(bào)道非常有限。2003年，Pagotto[9]首次描述了某種類腸毒素化合物可能是阪崎腸桿菌產(chǎn)生的一種毒力因子。阪崎腸桿菌在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的腸毒素是其致病的重要因素，侵入腦微血管上皮細(xì)胞后，其外膜蛋白A和外膜蛋白X能夠穿過(guò)血腦屏障，并存在于腦巨噬細(xì)胞中影響細(xì)胞因子的分泌，導(dǎo)致嚴(yán)重的大腦疾病，如新生兒腦膜炎、腦梗塞、腦囊腫等，是阪崎腸桿菌的重要致病因子[10-13]。本研究室在對(duì)阪崎腸桿菌新疆株的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為IQCC 10418號(hào)菌株在經(jīng)CAYE培養(yǎng)后，其培養(yǎng)上清中產(chǎn)生某種活性蛋白[14]能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生損傷，推測(cè)可能與阪崎腸桿菌致病有關(guān)。

圖2 兩組HepG2細(xì)胞中RPS18 mRNA檢測(cè)結(jié)果分析

圖3 兩組HepG2細(xì)胞中RFC4 mRNA檢測(cè)結(jié)果分析

本研究發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白侵襲HepG2肝細(xì)胞，通過(guò)提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄、高通量測(cè)序，異常表達(dá)基因有5 120個(gè)，包括2 155個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，2 965個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。CA9基因表達(dá)量較高，CA9基因編碼碳酸酐酶蛋白，是鋅金屬酶家族中一員，與機(jī)體的鈣代謝、酸平衡等有關(guān)；差異表達(dá)下調(diào)明顯的ACP1基因，編碼Acid phosphatase 1蛋白，該蛋白屬于磷酸酪氨酸蛋白家族成員之一，與酪氨酸代謝相關(guān)。還有部分差異表達(dá)基因如CALR基因、TMEM 基因等編碼的蛋白涉及細(xì)胞的一些重要功能，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣代謝等功能[15]。

在差異基因的GO富集和pathway分析[16-18]中還發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因參與了219個(gè)信號(hào)通路，阪崎腸桿菌侵襲HepG2肝細(xì)胞后，其差異基因的表達(dá)多為染色體、著絲粒、核糖體等變化，核糖體可從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)水平上調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控微生物的次級(jí)代謝，同時(shí)，核糖體結(jié)構(gòu)改變，其代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控系統(tǒng)也會(huì)出現(xiàn)變化，誘導(dǎo)真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及有絲分裂[19-20]；在差異表達(dá)基因的信號(hào)通路中，同樣涉及DNA的復(fù)制、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等多種通路，其中參與差異表達(dá)基因最多為Ribosome(hsa03010)，與蛋白的翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能相關(guān)，參與DNA的修復(fù)，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化。

進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證表明，RPS18是由RPS18基因編碼的一種蛋白，參與組成核糖體的40S小亞基，通過(guò)與起始因子以及其他核糖體蛋白相互作用，在翻譯起始過(guò)程中作為一種調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要的作用。此外，RPS18核糖體蛋白是一種公認(rèn)的Ca2+/鈣調(diào)蛋白激活的蛋白激酶II底物。研究表明，RPS18參與了阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白引起的HepG2肝細(xì)胞的病變，能夠調(diào)節(jié)HepG2肝細(xì)胞的毒力和致病力，參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。復(fù)制因子C(replication Factor C，RFC)是與DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)的蛋白，RFC在ATP存在的情況下，能將PCNA和DNA聚合酶δ裝配到附有引物的模板上，從而有效的延伸DNA復(fù)制鏈；而RFC4基因?qū)笵NA復(fù)制損傷修復(fù)能力具有重要的調(diào)控作用，如RFC4等基因下調(diào)可減緩肝癌細(xì)胞的增殖[21]。研究表明，RFC4基因上調(diào)，參與了DNA復(fù)制的過(guò)程，導(dǎo)致了阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清蛋白引起的HepG2肝細(xì)胞病變的發(fā)生。

綜上，從阪崎腸桿菌培養(yǎng)上清中分離純化的蛋白質(zhì)，可產(chǎn)生HepG2肝細(xì)胞病變，推測(cè)該蛋白質(zhì)的生物活性可能與RPS18、RFC4基因等差異表達(dá)，引起的核糖體、染色體、著絲粒等的變化相關(guān)，參與DNA的復(fù)制與修復(fù)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、精氨酸和脯氨酸代謝等多條信號(hào)通路。