不同方法降解綠茶渣制備水溶性還原糖

孔瑩瑩劉 安許 偉張 拓龔志華肖文軍,3

(1. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南農業大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128)

茶葉是中國主要經濟作物之一，在浙江、云南、安徽、湖南等地多有種植。中國每年茶葉深加工消耗茶葉1.0×105～1.5×105t，占茶葉總產量的7%～9%[1]，而日本、美國茶葉深加工占比已達到40%以上[2]，說明中國茶葉深加工產業發展空間巨大，且深加工后的茶渣并未得到妥善處理。研究發現，深加工后的茶渣仍殘留17%～19%的粗蛋白、16%～18%的粗纖維[3]，可做肥料、飼料和吸附劑，可從中提取利用蛋白、茶多糖[4]。其中，將茶渣纖維素轉化為燃料乙醇不僅能減少環境污染，還可緩解能源危機[5]。近期研究[6]發現Co60輻照可使油菜秸稈的纖維素發生鏈剪切和交聯反應，降解纖維素；堿處理玉米秸稈，可使纖維素的氫鍵斷裂[7]；孫萬里等[8]發現酸處理水稻秸稈能脫除木質素、半纖維素，使糖得率提高；彭資等[9]發現酸能促進輻照芒草纖維素降解糖化。然而，目前相關研究主要是以農作物秸稈為原料，鮮有對茶渣降解糖化的研究。已有研究[10]表明茶渣可用纖維素酶解，提取蛋白和還原性糖，但還原糖得率較低。以上研究擬主要使用單一技術降解，而非多種方法綜合降解。因此本研究擬以茶渣為原料，分別采用Co60輻照、氫氧化鈉、硝酸處理，并通過3,5-二硝基水楊酸法測定水溶性還原糖的得率，探討不同降解方法的效果，以期為茶葉深加工中茶渣的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茶渣：為中小種綠茶在茶水比1∶15 (g/mL)、95 ℃下提制30 min后的水提殘渣，于70 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩。經檢測，茶渣中有15.05%纖維素、4.21%果膠、1.76% 水溶性還原糖，含水量為4.73%；

乙二胺四乙酸二鈉、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、無水磷酸氫二鈉、濃硫酸、十六烷三甲基溴化銨、無水亞硫酸鈉、氰化萘、丙酮、無水草酸氨、氨水、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、冰乙酸、無水氯化鈣、葡萄糖標準物質、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、濃硝酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

電子天平：FA2104S型，上海精科天美儀器有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，浙江黃巖求精真空泵廠；

電熱鼓風干燥箱：101A-2型，上海實驗儀器總廠；

恒溫水浴鍋：HH數顯型，金壇市金城國勝實驗儀器廠；

可見光光度計：722E型，上海光譜儀器有限公司。

1.2 降解方法

1.2.1 輻照降解 選擇Co60為輻照源，將烘干后的茶渣以200，600，800，1 000，1 200 kGy的輻照劑量進行輻照降解，優選水溶性還原糖得率高的輻照劑量。

1.2.2 堿降解 以水溶性還原糖得率為指標，取1 g茶渣按1∶30 (g/mL)固液比降解。

(1) 分別用0.03，0.05，0.07，0.09，0.11 mol/L的氫氧化鈉降解，降解溫度均為80 ℃，降解時間均為90 min。

(2) 分別在60，70，80，90，100 ℃的溫度下，均用0.05 mol/L 氫氧化鈉降解，降解時間均為90 min。

(3) 分別降解1，2，3，4，5 h，均用0.05 mol/L氫氧化鈉降解，降解溫度均為80 ℃。

(4) 以氫氧化鈉濃度、降解溫度、降解時間為考察因子進行L9(33)正交試驗。

1.2.3 酸降解 以水溶性還原糖得率為指標，取1 g茶渣按1∶30 (g/mL)固液比降解。

(1) 分別用5%，7%，9%，11%，13%的硝酸降解，降解溫度均為85 ℃，降解時間均為90 min。

(2) 分別在60，70，80，90，100 ℃的溫度下，均用5%的硝酸降解，降解時間均為90 min。

(3) 分別降解0.5，1.0，1.5，2.0 h，均用5%的硝酸降解，降解溫度均為85 ℃。

(4) 將硝酸濃度、降解溫度、降解時間為考察因子進行L9(33)正交試驗。

1.2.4 輻照預處理+堿降解+酸降解 分別取1 g各劑量輻照后的茶渣，先按最佳堿降解工藝組合進行降解，再采用最佳酸降解工藝組合進行降解，檢測水溶性還原糖得率，獲得最優輻照降解+堿降解+酸降解綠茶水提茶渣制備水溶性還原糖的工藝技術組合。

1.3 理化指標測定方法

1.3.1 茶渣纖維素測定 參照文獻[11]。

1.3.2 茶渣果膠測定 按GB/T 10742—2008的重量法執行。

1.3.3 茶渣水溶性還原糖測定 參照文獻[12]。

1.3.4 茶渣中水分測定 按GB/T 8304—2013的120 ℃茶葉烘干法執行。

1.3.5 水溶性還原糖得率計算 根據式(1)計算水溶性還原糖得率。

(1)

式中：

R——水溶性還原糖得率，%；

m——茶渣降解后濾液中的水溶性還原糖量，g；

M——茶渣的樣重，g；

W——試樣含水量，%。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對茶渣水溶性還原糖的影響

由圖1可知，輻照吸收量高于200 kGy時，輻照可降解茶渣生成水溶性糖，并且輻照吸收量越大，生成水溶性糖越多。輻照吸收量為1 000 kGy時，纖維素降解為水溶性糖后，發生分子內脫水生成呋喃類物質，因此水溶性糖得率偏低。輻照吸收量為1 200 kGy時，纖維素最大程度裂變降解，水溶性糖得率最高，為4.13%。由此可知在一定輻照劑量范圍內，輻照劑量越大，得率越高，說明高能輻照能降低纖維素聚合度[13]，使大分子的纖維素降解為小分子物質。

圖1 輻照后茶渣中水溶性還原糖得率

Figure 1 The yield of water-soluble reducing sugar in tea residue with irradiation absorption

2.2 堿降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

2.2.1 氫氧化鈉濃度對水溶性還原糖得率的影響 纖維素與氫氧化鈉形成Na-cellulose復合結構，在堿的水合離子作用下溶解[14]。由圖2可知，在氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L時，水溶性糖得率最高。隨濃度的增加，堿纖維吸附多余的氫氧化鈉，水溶性糖得率降低。當濃度為0.03 mol/L時，降解前與降解后的還原糖含量相同，說明濃度過低的氫氧化鈉無法達到降解茶渣效果，因此選用0.05，0.07，0.09 mol/L的氫氧化鈉溶液進行正交試驗。

圖2 氫氧化鈉濃度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 2 The effect of concentration of sodiun hydroxide on the yield of water-soluble reducing sugar

2.2.2 氫氧化鈉降解溫度對水溶性還原糖得率的影響 由圖3發現，溫度低于90 ℃，水溶性還原糖得率隨溫度的增高而增加；降解溫度高于90 ℃，產物糖與蛋白質水解產生的氨基酸發生美拉德反應，水溶性還原糖得率隨溫度的升高而降低。

2.2.3 氫氧化鈉降解時間對水溶性還原糖得率的影響 在圖4中，降解時間在1 h內，隨降解時間的延長，水溶性還原糖得率增加。降低時間長于1 h，由于蛋白質大部分溶于溶液[15]，與產物糖發生反應的機率增大，使水溶性糖減少。為減小蛋白質水解產生的氨基酸對水溶性還原糖得率的影響，選用0.5，1.0，1.5 h進行正交試驗。降解時間超過2 h后，隨降解時間的延長，水溶性糖得率稍有增加。

圖3 氫氧化鈉降解溫度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 3 The effect of sodiun hydroxide degradation temperature on the yield of water-soluble reducing sugar

圖4 氫氧化鈉降解時間對水溶性還原糖得率的影響

Figure 4 The effect of sodiun hydroxide degradation time on the yield of water-soluble reducing sugar

2.2.4 氫氧化鈉降解的正交試驗 在單因素試驗基礎上，進行L9(33)正交試驗。正交試驗因素及水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，各因子對水溶性還原糖影響的主次順序為氫氧化鈉濃度>降解時間>降解溫度，在最優工藝技術組合下，即用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液于90 ℃降解1 h后，水溶性糖得率最高，為2.08%，說明堿可使纖維素分子發生潤漲降解[16]。

表1 氫氧化鈉降解的各因素正交試驗水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of sodium hydroxide degradation

水平A 溫度/℃B 氫氧化鈉濃度/(mol·L-1)C 時間/h1800.050.52900.071.031000.091.5

表2 氫氧化鈉溶液降解的正交結果

Table 2 The result of orthogonal experiment of sodiun hydroxide degradation

試驗號ABC含量/%11111.9121221.8431331.8742122.0852231.8062312.0273131.9383211.8593322.01K11.871.981.93K21.971.831.98K31.931.971.87R0.100.150.11

2.3 酸降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

2.3.1 硝酸濃度對水溶性還原糖得率的影響 由圖5可知，硝酸降解濃度為9%時，水溶性還原糖得率最高。因為硝酸濃度低于9%時，硝酸濃度越高，則氫離子濃度越高，對纖維素結構的破壞力更強，水溶性還原糖得率增加；當濃度高于9%時，水溶性還原糖在硝酸作用下生成糠醛、有機酸等副產物，得率降低，且硝酸濃度太高，受熱分解產生的NO2增多，污染環境。

圖5 硝酸濃度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 5 The effect of the concentration of nitric acid on the yield of water-soluble reducing sugar

2.3.2 硝酸降解溫度對水溶性還原糖得率的影響 由圖6可知，溫度高于80 ℃的得率較高，當降解溫度低于80 ℃時，缺少足夠的能量使纖維素的氫鍵斷裂，水溶性還原糖得率明顯偏低。

圖6 硝酸降解溫度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 6 The effect of nitric acid degradation temperature on the yield of water-soluble reducing sugar

2.3.3 硝酸降解時間對水溶性還原糖得率的影響 由圖7發現，隨降解時間的延長，纖維素降解率越高，還原糖得率越高。但纖維素降解的同時，伴隨著水溶性還原糖的降解，因此隨時間的延長，糖的增長速率減小。

2.3.4 硝酸降解的正交試驗 在單因素試驗基礎上，進行L9(33)正交試驗。正交試驗因素及水平見表3，正交試驗結果見表4。

由表4可知，各因子影響水溶性還原糖的主次順序為處理溫度>處理時間>硝酸濃度。最優的工藝技術組合為9%硝酸在100 ℃下降解2 h，未出現在正交組合中，需進行驗證實驗。取茶渣按最優條件降解，水溶性還原糖得率為(10.57±0.24)%，高于正交表中任一組合，符合正交分析結果。

2.4 輻照預處理+堿降解+酸降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

由圖8可知，在不同方法組合降解中，輻照吸收量低于1 000 kGy 時，輻照吸收量越大，木質素和半纖維素的降解率越大，從而水溶性還原糖得率越高。輻照吸收量為1 200 kGy 時，部分纖維素已降解成呋喃類物質，剩余的纖維素經過堿降解+酸降解，生成的水溶性還原糖偏少。輻照吸收量1 000 kGy時纖維素結構被充分破壞，且二次降解少，因此降解效果最優。取輻照量為1 000 kGy的茶渣用最優堿降解工藝降解，再用最優酸降解工藝降解，進行3次平行試驗得水溶性還原糖得率為(13.18±0.14)%，說明不同方法組合降解效果最優且方法穩定。組合降解中，輻照降解破壞纖維素與木質素、蛋白質構成聚合液晶結構[17]，堿降解使纖維素分子發生潤漲，增大酸與纖維素接觸面。

圖7 硝酸降解時間對水溶性還原糖得率的影響

Figure 7 The effect of nitric acid degradation time on the yield of water-soluble reducing sugar

表3 硝酸降解的各因素正交試驗水平

表4 硝酸降解的正交試驗結果

比較圖1與圖8可知，組合降解明顯優于單一降解。輻照后的茶渣經過堿、酸降解后，水溶性還原糖得率明顯增加，說明輻照降解的機理與酸堿降解機理不同。組合降解效果的大小不是單一降解效果的簡單疊加，所以組合降解實際效果可能與理論效果不同。

圖8 輻照吸收量對不同方法組合降解水溶性

Figure 8 The effect of irradiation absorption dose on the yield of soluble reducing sugar with degradation of different method combination

3 結論

不同降解方法的水溶性還原糖得率由高到低依次為：不同方法組合降解>酸降解>輻照降解>堿降解。其中，輻照降解在輻照吸收量為1 200 kGy時降解效果最佳，為4.13%；堿降解的最佳工藝組合為用0.05 mol/L氫氧化鈉于90 ℃降解1 h，水溶性還原糖得率為2.08%；酸降解的最佳工藝組合為用9%硝酸于100 ℃降解2 h，水溶性還原糖得率為10.57%。將綠茶茶渣先進行1 000 kGy的輻照預處理，然后用0.05 mol/L的氫氧化鈉于90 ℃處理1 h，再用9%的硝酸于100 ℃處理2 h，水溶性還原糖得率可達13.18%，即采用1 000 kGy輻照預處理+最佳堿降解+最佳酸降解的組合工藝是利用綠茶茶渣制備水溶性還原糖的最優工藝技術。