茶葉提取物體外抗氧化活性與其功能性成分含量的相關性研究

李 丹曹 永王 華馮云子伍錦鳴趙謀明

(1. 廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣東 廣州 510385；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

飲茶及茶文化在中國已有數千年的歷史。中國茶葉品種齊全，資源豐富，是世界上主要的茶葉生產、出口國。根據發酵的情況，茶葉可分為不發酵茶(綠茶、白茶)、半發酵茶(烏龍茶)、全發酵茶(紅茶)及后發酵茶(黑茶)等[1]。茶作為世界三大飲品之一，不僅口感佳、熱量低，且具有諸多保健功能，如抗氧化[2-3]、抗動脈硬化[4-5]、抗菌抗病毒[2]、護肝明目[3]和保護神經[6]等。將茶葉經過一定工藝制得提取物能強化其保健功效，通過提取工藝充分利用低質的茶末、茶碎等茶原料，可以增加產業附加值。

機體內自由基的大量存在是引發心血管疾病、機體老化及癌癥等疾病的重要原因，而隨著人們健康綠色環保意識的增強，食源性天然抗氧化劑的研究與開發具有重要意義，應用前景廣闊。研究表明茶葉及其提取物具有良好的抗氧化能力[7]，但研究多集中在水溶性組分[8]，對其醇提物涉及較少。而且在茶葉活性物質的研究工作中[6-7]，多集中在多酚的定量，然而其抗氧化活性物質在真實體系中的貢獻大小仍不清楚。重組模型驗證的思路來源于近年來興起的分子感官組學研究系統[9]，常用于香氣活性物質的研究，通過重組構建體系判斷香氣活性物質鑒定的全面性和活性貢獻特點非常實用[10]，然而采用重組模型驗證茶葉功能活性貢獻大小的研究未見報道。

本研究對比分析不同發酵類型的茶葉醇提物及水提物的功能性成分差異，以氧自由基的吸收能力(ORAC)和DPPH自由基的清除能力為指標，比較各樣品體外抗氧化活性，并建立活性指標與功能性組分含量的相關性，通過重組模型確定其中關鍵活性成分對總抗氧化活性的貢獻能力，旨在為新型天然抗氧化劑的開發及茶葉綜合利用價值的提高提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料

3種茶樣：分別自其產區購買，詳見表1。

表1 茶葉樣品信息

1.2 儀器

旋轉蒸發器：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

電子天平：EL 204/EL3002型，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；

數控超聲波清洗器：KQ-800KDE型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

調溫電熱器：Q/320683AAFA02-2005型，5 000 mL，上海蘇進儀器設備廠；

搖擺式中藥粉碎機：DFY-500型，溫嶺市林大機械有限公司；

循環水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，鞏義市予華儀器有限責任公司；

色譜柱：XBridge C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)型，美國Waters公司；

高效液相色譜儀：Waters-600型，美國Waters公司；

多功能酶標儀：Varioskan Flash型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

紫外可見分光光度計：UV-2100型，上海尤尼柯UNIC科學儀器有限公司。

1.3 試劑

濃硫酸、沒食子酸、抗壞血酸、鹽酸、乙醇、冰乙酸、苯酚、福林酚試劑、無水碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、葡萄糖：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

咖啡堿標準品：純度>98%，廣州鼎國生物技術有限公司；

熒光素鈉：純度>99%，上海源葉生物科技有限公司；

甲醇、乙腈：色譜級，德國Merck公司；

1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)、水溶性維生素E(Trolox)、谷氨酸、2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子酸(GA)標準品：純度>98%，美國Sigma公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備 將茶樣粉碎過40目篩，稱取50 g茶粉，加入80%乙醇或蒸餾水[料液比為1∶12 (g/g)]，加熱回流提取2 h。冷卻后過濾，濾液采用旋轉蒸發儀濃縮至100 mL左右，制得茶醇提物及水提物于4 ℃貯藏備用。

1.4.2 茶提物浸提得率測定 參照GB 50093—2010中恒重法，按式(1)計算得率。

(1)

式中：

c——茶葉提取物浸提得率，%；

m1——濃縮液干物質總重量，即濃縮液質量×干物質含量，g；

m2——茶葉干重，g。

1.4.3 茶提物主要功能性成分含量測定

(1) 茶多酚含量測定：采用福林酚比色法，按GB/T 8313—2008執行。

(2) 茶多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[11]。

(3) 游離氨基酸含量測定：采用水合茚三酮比色法，按GB/T 8314—2013執行。

(4) 兒茶素、咖啡堿、沒食子酸(GA)含量測定：采用高效液相法，按GB/T 31740.2—2015執行。

1.4.4 DPPH 自由基清除能力測定 根據Zheng等[12]的方法，修改如下：取2 mL茶提物或標準品混合物稀釋液與2 mL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)渦旋混勻，靜置常溫避光反應30 min后，于波長517 nm處測定吸光度(Asample)。取2 mL無水乙醇與2 mL樣液混合測得吸光值為Ablank，以等量無水乙醇代替茶樣測得吸光值標記為Acontrol，該研究以Trolox作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式(2)計算：

(2)

式中：

C——DPPH清除率，%；

Asample——樣品(樣品與DPPH乙醇溶液)的吸光值；

Ablank——空白樣品(乙醇與茶提物樣液)的吸光值；

Acontrol——對照組(乙醇與DPPH乙醇溶液)的吸光值。

將樣品濃度與其對應的自由基清除率進行擬合，建立線性回歸方程。清除率為50%對應的樣品或陽性對照的濃度即為IC50值。

1.4.5 氧自由基清除能力(ORAC值)測定 根據Lin等[11]的方法，修改如下：用pH 7.40磷酸鹽緩沖液(75 mmol/L)溶解和稀釋AAPH、熒光素鈉鹽、Trolox及待測樣品至相應濃度。在96孔板的微孔中依次加入25 μL茶提取物稀釋液/標準品混合物、pH 7.40的磷酸鹽緩沖液或Trolox標準液，7 nmol/L 的熒光素溶液75 μL。將96孔板在37 ℃下進行10 min 孵育后，加入AAPH溶液(12.8 mmol/L)100 μL，采用酶標儀開始計時反應并讀數(激發波長485 nm、發射波長538 nm)，反應時間120 min，每1 min 讀1次，共讀數121次。曲線下方的面積按式(3)計算：

AUC=0.5×(f0+f121)+(f1+f2+……+f120)，

(3)

式中：

AUC——曲線下方的面積；

f0——初始熒光強度，a.u.；

fi——第imin時的熒光強度，a.u.。

NetAUC=AUCsample-AUCblank，其中Trolox濃度與相應的Net AUC呈正比可建立方程，將樣品Net AUC代入方程，即得ORAC值。茶提物的ORAC值單位設為每克干物質相當于Trolox的量(μmol TE/g·DW)。

1.5 數據分析

試驗結果以“均值±標準偏差”表示(n≥3)。采用Microsoft Excel 2013作圖，SPSS 20.0軟件進行相關性分析和單因素方差分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 不同茶類提取物浸提得率及功能性成分分析

不同茶類醇提物及水提物浸提得率及主要功能性成分含量見表2。不同茶類提取物(tea extracts, TE)浸提得率具有顯著差異(P<0.05)。紅碎茶和普洱熟茶水提物的得率高于醇提物的，而信陽毛尖則是醇提物較高，可能是信陽毛尖為綠茶，其中茶多酚含量高，同時茶多酚在80%乙醇中比純水中的溶解度大，提高了其醇提物的提取得率。醇提物及水提物中得率高低順序都為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶，其中最高的為信陽毛尖醇提物(36.89%)。各主要功能性組分中茶多酚含量最高，茶多糖及咖啡堿次之，沒食子酸、蛋白質和氨基酸含量較少。

表2 不同茶提取物得率及其功能成分含量?

? 同列肩標字母不同表示數據間存在顯著性差異(P<0.05)。

3種茶的醇提物茶多酚含量都顯著高于其水提物，表明茶多酚在80%的乙醇溶液中溶解度更高。信陽毛尖2種提取物中的茶多酚含量都顯著高于普洱熟茶及紅碎茶，其中最高的為信陽毛尖醇提物(474.91 mg/g·DW)，這與各類茶的加工工藝有關。綠茶加工過程中經過殺青，使過氧化酶和多酚氧化酶等酶系失活，茶多酚不被氧化而損失。李大祥等[13]研究表明采用相同原料制得綠茶和紅茶，綠茶的茶多酚含量基本不變而紅茶則顯著下降。而普洱熟茶渥堆工藝中濕熱的環境和微生物作用也會導致酚類物質含量減少[14]。

信陽毛尖、紅碎茶及普洱熟茶水提物中茶多糖含量顯著高于醇提物，分別是醇提物中的1.94，1.87，3.05倍，表明水提法能將茶多糖更充分地提取出來。水提物中茶多糖含量從高到低排序為：普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖，且普洱茶水提物中的茶多糖含量(240.3 mg/g·DW)顯著高出紅碎茶和信陽毛尖(P<0.05)，這與黑茶后發酵過程中大量微生物作用促進茶葉中多糖分解為可溶性糖有關[15]。

提取物中咖啡堿含量在2種提取工藝中的高低順序一致，均為：普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖，咖啡堿為嘌呤堿雜環結構，較為穩定，隨發酵的進行降低并不顯著，因此咖啡堿主要取決于原料中的含量[16]。沒食子酸是茶多酚的結構組成單元，也是具有生理活性的簡單酚類化合物[17]，2種提取物中普洱茶的沒食子酸含量皆最高。茶葉醇提物中蛋白質含量比水提取中高，但總體含量較低，是由于茶葉80%的蛋白質主要為難以溶解的谷蛋白，而可溶性的主要為醇溶谷蛋白[18]。氨基酸在水提物中含量顯著高于醇提物，且水提物中信陽毛尖、紅碎茶的茶氨酸含量分別為普洱茶的5.18，4.03倍，這主要是黑茶工藝中的“渥堆作用”導致大量茶氨酸被破壞，含量急劇降低[19]。

不同茶提取物中5種兒茶素的定量結果見表3。兒茶素是茶葉多酚類物質的主體成分，約占茶多酚總量的70%～80%[17]，由表3可知，茶多酚含量與兒茶素總量存在極顯著相關性(P<0.01)，相關系數為0.928，說明兒茶素總量在各茶類中的變化趨勢與茶多酚一致。醇提物中兒茶素總量顯著高于水提物(P<0.05)，其中信陽毛尖醇提物兒茶素總量最高(451.88 mg/g·DW)。紅碎茶與普洱熟茶的醇提物及水提物的兒茶素總量都無顯著差異，僅為信陽毛尖2種提取物總量的1/7及1/3。不同茶類加工工藝不同是造成兒茶素含量差異顯著的主要原因。關于紅茶工藝的研究[20]結果表明，揉切和發酵過程會使兒茶素含量減少近75%。茶葉的酯/簡比值(酯型兒茶素：簡單兒茶素)越高其相應的功能活性越強，信陽毛尖的醇提物和水提物及紅碎茶醇提物酯/簡比值都高于1，分別為3.88，1.43，1.14，表明可能具有較強的活性，酯型兒茶素的保健功能較強，具有抗氧化、抗腫瘤、保護神經心腦血管、代謝酶干預、免疫內分泌等作用[21]，其中又以EGCG和EGC的活性較高[22]。

表3 不同茶提取液中兒茶素組分及含量?

? “酯/簡”表示酯型兒茶素含量與簡單兒茶素含量的比值；同列上標字母不同表示數據存在顯著性差異(P<0.05)。

2.2 不同茶類提取物的抗氧化活性分析

2.2.1 氧自由基吸收能力 氧自由基吸收能力法是Cao等[23]在Glazar[24]的研究基礎上建立起來的一種評價樣品總抗氧化活性的化學方法，具有靈敏高，適用性廣泛等特點。ORAC法根據自由基破壞熒光探針導致熒光強度變化的原理，以Trolox為定量標準、熒光素鈉為熒光物質、AAPH為過氧自由基來源。當抗氧化劑對ROO自由基作用時會引發熒光強度變化，采用熒光酶標儀測定抑制作用變化過程。如表4所示，不同茶類醇提物的ORAC值都顯著高于其相應水提物的，說明醇提物的氧自由基吸收能力更強。醇提物中3種茶類的ORAC值具有顯著差異，其大小順序為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。徐維盛等[25]采用ORAC法比較16種茶葉的抗氧化能力發現綠茶>黑茶>紅茶，與本研究結果一致。而3種茶類的水提物都有一定氧自由基吸收能力但無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 對DPPH自由基的清除能力 20世紀50年代末由Marden Blois[26]提出的DPPH自由基清除能力法，目前已發展成為評價和篩選化合物及天然提取物體外抗氧化能力的常用方法。不同茶類提取物的DPPH自由基的的半數清除率(IC50)見表5。提取物濃度與其對應的DPPH自由基清除作用存在良好的線性關系(相關系數為0.993～0.997)。

表4 不同品種茶葉提取液ORAC值?

? 同列肩標字母不同表示數據存在顯著性差異(P<0.05)。

不同茶類的醇提物IC50值顯著低于其對應的水提物，說明醇提物具有更強的DPPH自由基清除能力。與對照組相比，僅有信陽毛尖醇提物的DPPH自由基清除能力顯著高于Trolox。2種提取物中各類茶的IC50值具有顯著差異(P<0.05)，且大小順序一致：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。周金偉等[27]測定各類茶的DPPH自由基的清除能力發現不發酵茶抗氧化能力明顯強于發酵茶，與本研究結果一致，這表明抗氧化能力受加工工藝的影響。

2.2.3 體外抗氧化活性與其功能性成分含量的相關性分析

不同茶提物中主要功能性成分含量與體外抗氧化能力(ORAC及1/IC50值)的相關性見表5。茶多酚含量與茶提物的ORAC及DPPH值呈顯著正相關(P<0.05)，相關系數分別是0.897及0.914，表明茶多酚含量越高，茶提物對氧自由基與DPPH自由基的清除能力越強，此結果與陳雪[28]的研究相符。兒茶素為茶多酚中的主體成分，5種主要兒茶素總量與ORAC值及1/IC50值呈極顯著正相關(P<0.01)，其中ECG含量與ORAC及1/IC50都呈極顯著相關性(P<0.01)，EGC、EC與ORAC值呈極顯著相關性(P<0.01)，而與1/IC50呈顯著相關(P<0.05)。EGCG則與2個抗氧指標都有顯著相關性(P<0.05)。值得注意的是，兒茶素的酯/簡與ORAC和1/IC50呈顯著相關性(P<0.05)，說明酯/簡比值越高其相關的抗氧化能力越強，而酯型兒茶素(特別是ECG)的含量是影響茶提物中氧自由基及DPPH自由基清除能力的重要因素。

表5 茶葉提取液DPPH自由基清除活力?

? 同列肩標字母不同表示數據間存在顯著性差異(P<0.05)。

表6 茶提取物中功能成分含量與體外抗氧化能力的相關系數?

Table 6 Relationship between the functional components contents and the anti-oxidant activities

成分相關系數ORAC1/IC50茶多糖-0.543-0.712茶多酚0.897*0.856*蛋白質0.5230.667沒食子酸-0.465-0.550咖啡因0.1070.151茶氨酸-0.384-0.393兒茶素總量0.944**0.918**EGC0.946**0.882*C0.6960.757EGCG0.815*0.885*EC0.922**0.841*ECG0.921**0.936**酯/簡0.886*0.894*

? *表示在P<0.05水平上差異顯著，**表示在P<0.01水平上差異顯著。

2.2.4 體外抗氧化活性與兒茶素、沒食子酸含量的關系 根據以上分析結果，試驗獨立選取相關性較高的5種兒茶素和沒食子酸標品，并根據其在各茶提物中的含量(表2、3)進行復配，得到標品混合物STE。通過測定并比較TE及STE的ORAC、DPPH值，進一步探究5種兒茶素和沒食子酸對樣品抗氧化能力的貢獻作用，ORAC和DPPH的貢獻率分別按式(4)、(5)計算：

(4)

(5)

式中：

R1——ORAC的貢獻率，%；

R2——DPPH的貢獻率，%；

ORACSTE——標品混合物的ORAC值；

ORACTE——茶葉提取物的ORAC值；

DPPHSTE——標品混合物的DPPH值；

DPPHTE——茶葉提取物的DPPH值。

由圖1可知，3種茶的STE-E及STE-W的ORAC值較其相應的茶提物差異顯著。信陽毛尖STE-E的ORAC值貢獻率最高，達90.08%，說明信陽毛尖醇提物中的5種兒茶素及沒食子酸為其氧自由基清除能力的主要貢獻體。而作為發酵茶的紅碎茶和普洱熟茶的STE-E貢獻率分別僅為45.94% 及45.13%，不超過50%。說明通過發酵或后發酵工藝后，一方面兒茶素的含量會隨著發酵的進行而減少，所以茶提物中兒茶素及沒食子酸的抗氧化貢獻明顯減少，另一方面，通過發酵和后發酵過程會生成其他具有抗氧化活性的物質。屠幼英等[29]發現，紅茶中多酚氧化產物茶黃素具有較好的抗氧化活性。

TE-E、TE-W分別指茶葉醇提物及水提物；STE-E、STE-W分別指根據茶醇提物及水提物中的成分含量配制成的標準品混合物(含C、EC、ECG、EGC、EGCG及沒食子酸)

圖1 不同品種茶葉提取液及相應標品混合物的ORAC值

Figure 1 The ORAC value of different tea extracts and the corresponding standard mix

由圖2可知，3種茶的STE-E及STE-W的DPPH值較其相應的茶提物差異顯著，其中信陽毛尖STE-E對茶提物的抗氧化性貢獻率最高，達61.31%，而紅碎茶STE-E最低，僅為23.30%。而水提物中3種茶的STE-W的DPPH值貢獻率差異不大(34.57%～43.44%)。6種STE中僅有信陽毛尖STE-E貢獻率超過50%，說明茶提物中除5種兒茶素及沒食子酸外，其他功能性物質對DPPH的清除也起了重要作用。同時茶葉工藝的不同也影響茶類STE-E的貢獻率，不發酵茶中兒茶素及沒食子酸的貢獻率明顯大于發酵茶提物。

TE-E、TE-W分別指茶葉醇提物及水提物；STE-E、STE-W分別指根據茶醇提物及水提物中的成分含量配制成的標準品混合物(含C、EC、ECG、EGC、EGCG及沒食子酸)

圖2 不同品種茶葉提取液及相應標品混合物的DPPH自由基清除能力

Figure 2 The values of different tea extracts and the corresponding standard mix for scavenging DPPH free radicals

3 結論

試驗結果表明，3種茶類醇提物及水提物的組分含量和抗氧化活性差異顯著。醇提物中茶多酚(信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶)、咖啡因及蛋白質的含量較高，而水提物中以茶多酚、茶多糖(普洱熟茶>紅碎茶>信陽毛尖)及茶氨酸為主，這些差異與原料來源及茶葉加工工藝有關。兒茶素總量與茶多酚含量呈極顯著相關(P<0.01)，信陽毛尖的2種提取物與紅碎茶醇提物的兒茶素酯/簡值>1。3種茶類的醇提物對氧自由基吸收及DPPH自由基清除能力都比其水提物強，且3種茶類醇提物的ORAC值與IC50值的大小趨勢一致為：信陽毛尖>普洱熟茶>紅碎茶。DPPH和ORAC結果與提取物中茶多酚含量、兒茶素單體(ECG、EC、EGC、ECGC)、兒茶素總量和酯/簡值都呈顯著相關性，酯型兒茶素(ECG和EGCG)的含量對DPPH自由基清除能力及ORAC活性具有較大貢獻。兒茶素與沒食子酸標品復配試驗表明，5種兒茶素(ECG、EC、C、EGC、ECGC)和沒食子酸是信陽毛尖茶提物中主要抗氧化組分；而紅碎茶、普洱熟茶因經發酵處理生成其他抗氧化活性組分，亟待進一步研究。