副溶血性弧菌拮抗菌的篩選鑒定及抑菌物質特性研究

郝彥利汪立平,2黃宇良薛美翠崔云云趙 勇,3李 立王正全

(1. 上海海洋大學食品學院，上海 201306；2. 上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306；3. 農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室﹝上海﹞，上海 201306)

副溶血性弧菌既是水產養殖動物細菌性疾病的主要致病菌，又是引起細菌性食物中毒的首要食源性致病菌[1]。水產養殖業中副溶血性弧菌病的防治主要是利用抗生素，但抗生素的濫用不僅產生耐藥菌株[2]，破壞水產養殖環境生態平衡，而且抗生素類藥物在水產品中的殘留也給人類健康帶來威脅。利用益生菌所產抗菌肽來控制副溶血性弧菌病害的發生，投放益生菌所產抗菌肽既可以維持水產動物腸道菌群平衡，提高水產養殖動物免疫力，又可改善養殖水體環境[3]。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指生物體內能抵御外界微生物侵害的一類小分子多肽，是生物天然免疫防御系統的重要組成部分。目前研究最多使用最廣的微生物抗菌肽是乳酸菌抗菌肽以及芽孢桿菌抗菌肽[4]，但乳酸菌所產抗菌肽抑菌譜比較窄，芽孢桿菌抗菌肽在應用于水產養殖方面更具優勢，是因為芽孢桿菌可產芽孢，抗逆性強，而且芽孢桿菌可產生多種抗菌肽，抑菌譜廣，使其與其他非芽孢類的抗菌肽相比更具開發價值。

1986年，Kozasa等[5]將分離自土壤中的東洋芽孢桿菌應用于水產養殖中，用該菌株處理日本鰻鱺，結果顯示，與對照組相比，處理組的鰻鱺死亡率明顯降低。而后陸續有研究人員將枯草芽孢抗菌肽應用于副溶血性弧菌病的防治中，例如，Xu等[6]從納豆中篩選出1株產抗菌肽的枯草芽孢桿菌NT-6，在飼料中添加適量的NT-6抗菌脂肽不僅可以促進凡納濱對蝦的生長，還可以抑制副溶血性弧菌的生長[7]；王嬌等[8]從養殖環境中篩選出1株可抑制副溶血性弧菌的枯草芽孢桿菌A4，并改善了南美白對蝦的生長狀態；Nath等[9]從凝乳中篩選出1株枯草芽孢桿菌FPTB23，對副溶血性弧菌有較好的抑制作用。但是，目前報道的從海洋環境中分離的枯草芽孢桿菌比較少，其中阮乾坤[10]從大連海域中篩選到1株海洋枯草芽孢桿菌HS-A38，可抑制副溶血性弧菌。此外，對枯草芽孢桿菌產生的抑菌物質的性質研究也不夠深入。本試驗擬從海水中篩選對副溶血性弧菌有較好抑制作用的枯草芽孢桿菌，并對其產生的抑菌物質的性質進行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

海水：上海浦東新區臨港海域(30°42′5.8″N，121°53′31.6″E)。

1.1.2 指示菌及培養條件

指示菌及培養條件詳見表2。

1.1.3 培養基

分離、純化及形態觀察培養基：營養瓊脂培養基[11]；

種子培養基：Landy液體培養基[12]；

發酵培養基：Landy液體培養基[12]；

指示菌培養基：LB培養基[13]、TSB-YE培養基[13]、MRS培養基[13]、YPD培養基[14]。

1.1.4 主要試劑

胰蛋白酶(Trypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、木瓜蛋白酶(Papain)、蛋白酶K(Proteinase K)、中性蛋白酶(Neutral protease)：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司；

Ezup 柱式細菌基因組DNA 抽提試劑盒、通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')及1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒：康為世紀生物科技有限公司。

1.1.5 主要儀器

可見分光光度計：7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

冷凍離心機：H2050R型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-30FA型，上海申安醫療器械廠；

梯度PCR儀：A300型，杭州朗基科學儀器有限公司；

潔凈工作臺：SW-CJ-1F型，上海博迅實業有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海雷磁儀器有限公司；

恒溫調速回轉式搖床：DKY-II型，上海杜科自動化設備有限公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京市六一儀器廠；

垂直電泳槽：JY-SCZ2+型，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗副溶血性弧菌枯草芽孢桿菌的篩選

(1) 菌株的分離：準確量取25 mL海水樣品，放入含有225 mL的0.85%無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質10 min(10次/s)，90 ℃水浴10 min[15]，10倍系列稀釋至10-4，取各梯度稀釋液100 μL涂布營養瓊脂分離培養基，37 ℃培養12 h，挑取具有芽孢桿菌典型形態的菌落進行劃線純化，純化3次。

(2) 菌株的初篩：采用點種法[16]。將副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)接種于LB培養基中，37 ℃條件下150 r/min培養12 h，制備菌懸液使其菌濃度達到106CFU/mL。將純化得到的具有芽孢桿菌典型形態的菌株點種在混有副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)的LB培養基平板上，37 ℃培養12 h。試驗重復3次。對具有抑菌效果的菌株進行下一步復篩。

(3) 菌株的復篩：采用打孔法[17]。將初篩得到的菌株在LB平板上37 ℃活化培養18 h，并轉接2次，接種到Landy種子培養基中，37 ℃、150 r/min震蕩培養24 h，再以3%的接種量接種到Landy發酵培養基中，37 ℃、150 r/min震蕩培養24 h。10 000 r/min、4 ℃離心15 min，取其上清液用無菌0.22 μm濾膜過濾，得到無細胞發酵上清液。以副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，R11)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，BYK00516)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，ATCC19114)為指示菌，菌濃度均為106CFU/mL，通過打孔擴散法(50 μL/孔)進行復篩，參照Liu等[17]的方法進行改進，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈的直徑。試驗重復3次。選擇對這4種指示菌均有抑制作用且抑菌效果比較好的菌株進行下一步抑菌譜的測定。

1.2.2 菌株H19產抑菌物質的抑菌譜測定 將篩選獲得有抑菌效果的H19菌株制備無細胞發酵上清液，分別取50 μL無細胞發酵上清液采用打孔擴散法[17]測定其對19種指示菌(水產致病菌，食源性致病菌、真菌及其培養條件見表2)抑菌圈的直徑，試驗重復3次。

1.2.3 抗副溶血性弧菌枯草芽孢桿菌菌株的鑒定 根據枯草芽孢桿菌菌落形態進行初步鑒定，再通過革蘭氏染色法在光學顯微鏡下觀察枯草芽孢桿菌菌株的形態，之后進一步進行16S rDNA分子鑒定[18]，所得測序結果利用NCBI中BLAST軟件比對，并在EZBioCloud網站中查找與其同源性較近菌株的序列，最后利用MAGE 5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.4 菌株H19產抑菌物質的理化性質

(1) 菌株H19產抗菌物質的溫度穩定性測定：分別取10 mL無細胞發酵上清液，置于-20，0，20，40，60，80，100，121 ℃條件下處理10 min和30 min，然后立即在25 ℃條件下水浴2 h達室溫后，以副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)為指示菌，以抑菌活性為指標，抑菌活性的計算方法詳見參考文獻[13]，試驗重復3次。

(2) 菌株H19產抗菌物質的酸堿穩定性測定：分別取10 mL無細胞發酵上清液，用2 mol/L的HC1溶液和2 mol/L 的NaOH溶液調節菌株H19的無細胞發酵上清液的pH，使其pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，37 ℃溫浴保存2 h，再調回其初始pH 7.0，以副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)為指示菌，以未處理組作為對照，以抑菌活性為指標[19]，抑菌活性的計算方法同1.2.4(1)。試驗重復3次。

(3) 菌株H19產抗菌物質的紫外線穩定性測定：分別取10 mL無細胞發酵上清液，并置于10 mL離心管中距30 W紫外燈90 cm處照射處理10，20，30，40，50，60 min，以副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)為指示菌，以未處理組作為對照，以抑菌活性為指標[20]，抑菌活性的計算方法同1.2.4(1)。試驗重復3次。

1.2.5 菌株H19產抗菌物質的初步鑒定

(1) 抑菌物質的粗提及分子量的測定：在200 mL無細胞發酵上清液中緩慢加入硫酸銨至終飽和度為60%[21]，用磁力攪拌器在4 ℃冰浴條件下緩慢攪拌約4 h后，置4 ℃冰箱中靜置沉淀12 h[22]，在4 ℃于10 000 r/min離心30 min，得到沉淀物和離心液，沉淀以原菌液1/10體積的25 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)懸浮。將所得懸浮液分別選取孔徑為1，3.5，7，8～14 kDa的透析袋進行透析，4 ℃條件下透析48 h，聚乙二醇20000濃縮至原體積[23]，得到蛋白粗提液。以相同量的磷酸鹽緩沖液為對照1，以未透析的懸浮液為對照2，測定粗提液的抑菌效果以及初步判斷H19所產抑菌物質的分子量。試驗重復3次。

利用低分子質量Marker(4.1～66.0 kDa共9條帶)，取1 kDa 透析袋處理的蛋白粗提液于垂直電泳槽中進行Tricine-SDS-PAGE蛋白質電泳[24]。電泳結束后，將膠切成兩半，將帶有Marker的一半膠進行考馬斯亮藍快速染色，另一半用滅菌的去離子水漂洗12 h后，小心鋪在接有副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)的LB固體培養基上(1.0%瓊脂)，37 ℃培養12 h，與染色的一半作對比，判定抑菌物質的分子質量。試驗重復3次。

(2) 粗提液對蛋白酶的敏感性：分別將胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及蛋白酶K配制成質量濃度均為4 mg/mL的母液，分別加入3.5 kDa透析袋處理的蛋白粗提液使各酶的終質量濃度為2 mg/mL[25]，調節pH值至各酶最適作用pH值，以不加酶的3.5 kDa透析袋處理所得蛋白粗提液作為空白對照，37 ℃溫浴保存2 h，再調節各酶解液pH值至7.0。以副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)為指示菌，采用打孔擴散法測定各酶解液抑菌活性。試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 抗副溶血性弧菌枯草芽孢桿菌的篩選

從上海市東海采集的海水樣品中分離得到菌株50株，并分別命名為H1～H50，初篩后有7株對副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)有抑菌活性，分別為菌株H1、H3、H4、H6、H12、H19、H21，將初篩得到的7株菌株進行復篩，并測定抑菌效果，結果見表1。結果顯示，菌株H1和H12僅可抑制ATCC17802，菌株H4可抑制ATCC17802及R11，菌株H6和H21可抑制R11、ATCC17802以及ATCC19114，菌株H3和H19對這4種指示菌均有抑菌活性，但菌株H19的抑菌效果最強，且抑菌效果穩定。因此，選擇菌株H19進行后續的試驗。

2.2 菌株H19發酵液的抑菌譜測定

通過19株指示菌進行菌株H19抑菌物質的抑菌譜測定，其中包括常見的水產致病菌、主要的食源性致病菌以及酵母菌，由表2可以看出，菌株H19可抑制7株革蘭氏陽性菌，9株革蘭氏陰性菌，2株酵母菌，即既可抑制革蘭氏陽性菌又可抑制大部分革蘭氏陰性菌，且對革蘭氏陽性菌抑菌效果強于革蘭氏陰性菌，7株革蘭氏陽性菌抑菌直徑為(16.16±0.09)～(28.53±0.15) mm，9株革蘭氏陰性菌的抑菌直徑為(11.17±0.05)～(22.00±0.10) mm；僅對革蘭氏陰性菌副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC 33847)以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，H-1)無抑制作用。

2.3 菌株H19的鑒定

2.3.1 菌株H19的菌落形態 由圖1可知，菌株H19經培養后，菌落形態為圓形，污白色，褶皺不透明，凸起，邊緣不整齊；經革蘭氏染色后，通過光學顯微鏡觀察呈藍色，菌株H19為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，符合枯草芽孢桿菌的形態特征。

表1 海洋抑菌枯草芽孢桿菌對4種致病菌的抑菌情況?

? ++++代表抑菌圈直徑>20 mm；+++代表抑菌圈直徑15～20 mm；++代表抑菌圈直徑10～15 mm；+代表抑菌圈直徑<10 mm；-代表抑菌圈直徑≤7 mm。

表2 枯草芽孢桿菌H19的抑菌譜?

? “G+”代表革蘭氏陽性菌，“G-”代表革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株H19 在營養瓊脂平板上的菌落形態和營養肉湯液體培養基的顯微形態(10×100)

Figure 1 Colonial morphology on NA plate and microscopic morphology (10×100) in NB culture medium of H19 strain

2.3.2 菌株H19的分子鑒定 提取菌株H19的總DNA，以菌株H19的基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到特異性擴增產物長度為1 000～2 000 bp (圖2)，經生工生物工程(上海)股份有限公司測序，菌株H19的16S rDNA序列大小為1 172 bp，菌株H19的基因序列在GenBank上利用BLAST軟件進行序列比對，結果顯示，菌株H19與枯草芽孢桿菌KCTC 13429的相似度高達99%；結合菌株形態學特征、菌落形態學特征以及16S rDNA序列，結果該菌被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為BacillussubtilisH19，簡稱H19。將H19在EZBioCloud網站中進行比對，獲得的相似度較高的基因序列利用MEGA 5.0軟件構建菌株H19的系統發育樹(Neighbor-Joining法)，見圖3。將得到的測序結果提交到GenBank數據庫中，獲得登陸號為：MG383451。

2.4 抑菌物質的理化性質

2.4.1 溫度穩定性 由圖4可以看出，菌株H19抑菌物質在-20～80 ℃時具有良好的穩定性，100 ℃處理10 min抑菌活性下降為320 AU/mL，仍保留50%的抑菌活性，因此，H19抑菌物質在中低溫條件下具有良好的穩定性，但不耐高溫，此溫度特性為后續試驗研究提供了數據支撐。

Marker. DL2000 1. 菌株H19的PCR產物

圖3 基于16S rDNA基因序列構建的枯草芽孢桿菌H19系統發育樹

Figure 3 Phylogenetic tree ofBacillussubtilisH19 constructed based on 16S rDNA gene sequence

2.4.2 酸堿穩定性 如圖5所示，相對于對照組，菌株H19抑菌活性物質在pH 2.0～9.0時保持比較穩定的抑菌活性，但在pH 10.0～12.0時抑菌活性明顯下降，僅保留微弱的活性，由此可見H19抑菌在酸性、中性以及弱堿性條件下穩定性較好且較穩定，而在強堿性條件下穩定性是極差的。因此為后續H19抑菌物質的分離純化試驗中所需pH條件提供了依據[26]。

2.4.3 紫外線穩定性 由圖6可以看出，紫外線將菌株H19抑菌物質處理10～60 min對其抑菌活性均無影響，表明H19抑菌活性物質具有良好的紫外線穩定性。

圖4 溫度對H19抑菌活性的影響

圖5 pH對H19抑菌活性的影響

圖6 紫外線對H19抑菌活性的影響

2.5 抑菌物質的初步鑒定

2.5.1 抑菌物質的粗提 為了驗證枯草芽孢桿菌所產抑菌物質是否為抗菌肽，以及確定其分子量，抑菌物質經1，3.5，7，8～10 kDa透析袋處理后，得到4種粗提液，其抑菌活性分別為1 280，1 280，1 280，320 AU/mL(圖7)。與未透析的懸浮液相比，用1，3.5，7 kDa透析袋處理抑菌活性均略有提高，但3組之間不存在明顯差異，而當透析袋孔徑增大至8～14 kDa 時，抑菌活性略有降低。表明前3種透析袋都能將主要抑菌成分有效截流，最后1種透析袋只能部分截留，初步判斷抑菌物質的分子質量在7～8 kDa以及大于8 kDa。為防止粗提液中抗菌成分的遺漏，后續用1 kDa透析袋處理所得透析液進行下一步的Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳原位抑菌試驗。

圖7 不同孔徑透析袋處理對Bacillus subtilis H19 粗提液抑菌活性的影響

Figure 7 Effect of dialysis treatment on antibacterial activity of crude extract from fermentation supernatant ofBacillussubtilisH19 strain

2.5.2 H19抑菌物質分子量的測定 1 kDa透析袋處理的蛋白粗提液經過Tricine-SDS-PAGE分析，結果見圖8。在考馬斯亮藍染色后的電泳膠中可以看出有5條蛋白條帶，通過在VbrioparahaemolyticusATCC17802的LB固體培養基得到的2條抑菌條帶位置與這5條蛋白條帶進行對比可知，H19粗提物中有抑菌活性的蛋白質分子量在6.5～9.5 kDa以及27.0～35.0 kDa，同時驗證了2.5.1的結論。

M. 蛋白質分子質量標準 1、2. 經過考馬斯亮藍染色的2條平行樣品條帶 3. 副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC17802)平板上的抑菌活性條帶

圖8 Tricine-SDS-PAGE分析及電泳后抑菌活性的測定

Figure 8 Tricine-SDS-PAGE analysis and detection of antibacterial activity after Tricine-SDS-PAGE

枯草芽孢桿菌所產抗菌肽主要分為兩大類：核糖體途徑肽和非核糖體途徑肽，核糖體途徑肽主要包括subtilin、ericin、mersacidin、sublancin、bacillocin、subtilosin和TasA等，非核糖體途徑肽主要包括surfacrin、iturin和fengycin三大抗菌脂肽[27]，其中細菌素mersacidin[28]、subtilinUK4[29]、ericinA[30]、sublancin168[31]、bacillocin22[32]、subtilosinA[33]等的分子量為1.8～3.8 kDa，大分子抗菌蛋白TasA分子量大小為31.0 kDa[34]，3大抗菌脂肽分子量為1.0～1.5 kDa[35]，說明細菌素H19不在報道的枯草芽孢桿菌產生的抗菌肽范圍之內。因此，初步判斷菌株H19產生的抑菌物質可能為2種新型抗菌肽。

2.5.3 粗提液對蛋白酶的敏感性 由2.5.2可知H19抑菌物質的分子量在6.5 kDa以上，因此選擇經3.5 kDa透析袋處理所得的粗提液進行蛋白酶敏感性試驗，將此粗提液用5種不同蛋白酶處理，檢測其抑菌活性。如圖9所示，經木瓜蛋白酶、蛋白酶K處理后，菌株H19粗提液的抑菌活性完全消失，而用胰蛋白酶處理剩余64.61%的活性，用胃蛋白酶處理剩余83.07%的活性，對中性蛋白酶不敏感，表明H19抑菌物質為蛋白質性質。

圖9 蛋白酶處理對Bacillus subtilis H19 粗提液抑菌活性的影響

Figure 9 Effect of protease treatment on antibacterial activity of crude extract from fermentation supernatant ofBacillussubtilisH19 strain

3 結論

本研究從上海市東海海水樣品中篩選出既可抑制水產致病菌又對食源性致病菌有抑制作用、產抑菌物質的枯草芽孢桿菌。菌株H19對絕大多數指示菌具有較好的抑菌作用，相比于Stein等[31]和孫珊等[37]報道的枯草芽孢桿菌產抑菌物質的抑菌譜，菌株H19抑菌物質的抑菌譜更廣，對供試的所有革蘭氏陽性菌株均具有較好的抑菌活性，對除副溶血性弧菌(Vbrioparahaemolyticus，ATCC33847)以外的所有供試革蘭氏陰性菌株也都具有較好的抑菌活性，且對革蘭氏陽性菌抑菌效果強于革蘭氏陰性菌，可見，H19產生的抑菌活性物質具有廣譜的抑菌作用。H19所產抑菌物質具有較好的熱穩定性，在100 ℃處理10 min后仍保留50%的抑菌活性，在pH 2.0～9.0時仍保持較強的抑菌活性，H19抑菌活性物質具有良好的紫外線穩定性，在紫外線下照射10～60 min 對抑菌活性物質的抑菌效果均無影響。通過將H19抑菌物質粗提得粗提液，將粗提液進行5種蛋白酶處理以及Tricine-SDS-PAGE電泳原位抑菌試驗，初步鑒定此粗提液為蛋白質性質，分子量在6.5～9.5 kDa以及27.0～35.0 kDa，由于該抑菌物質有別于已報道的抗菌肽分子量，推斷可能為2種新型細菌素。

本研究將會繼續對H19抑菌活性物質進行分離、純化和結構鑒定，進一步確定H19所產細菌素的種類以及氨基酸成分等。