發酵型桑葚果酒主要成分動態變化規律及香氣成分分析

楊 芳劉 鐵劉 燕王 沙王丹紅

(1. 安康學院現代農學與生物科技學院，陜西 安康 725000；2. 陜西省蠶桑重點實驗室，陜西 安康 725000；s3. 安康學院數學與統計學院，陜西 安康 725000)

桑葚營養豐富，具有良好的保健功能。相較于中國豐富的桑葚資源，目前圍繞桑葚開發利用的產品數量、質量還遠遠不夠。桑葚因其果肉多汁、香氣幽雅、色素含量高且穩定是釀酒的極佳原料[1]。桑葚中黃酮類化合物具有增強毛細血管強度、抗自由基[2]、抗病毒[3-4]、抗炎、調節血脂、對抗膳食丙烯酰胺引發的細胞毒性等生物學活性[5]。果酒中有機酸含量的高低與果酒品質有著密切的關系[6]。有機酸具有抑菌、抗病毒、增加冠動脈流量、抑制腦組織脂質過氧化等作用。桑葚中有機酸以檸檬酸為主[7]。有機酸同時也是決定果酒口感的重要風味物質。乙醇是影響果酒香味和滋味的重要化學成分。乙醇含量過高，酒香蓋住了果香。乙醇含量過低，不僅酒體缺失酒香，也缺少了酒類飲料特有的醇厚純凈。糖類物質是果酒發酵的主要成分，也是果酒中乙醇、有機酸產生的重要來源。果酒中殘存的總糖成為衡量果酒品質的重要理化指標之一。

黃正勇等[8]的研究指出桑葚果酒發酵過程質量控制的3個要素分別為蔗糖添加量、酵母菌的選擇及接種量、發酵溫度及時間控制。前期研究利用星點設計—響應面優化的桑葚果酒發酵工藝發酵溫度為15.3 ℃[9]，低于文獻[8,10]報道的推薦溫度20 ℃，釀制的桑葚果酒乙醇含量達14%[9]。本試驗分析該工藝條件下桑椹果酒發酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮的變化規律，同時對該工藝條件下桑椹果酒香氣成分進行分析，確定發酵總時間，以期為發酵型桑葚果酒的進一步開發提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 桑葚及酵母菌

桑葚：大十新鮮桑葚，產自陜西省安康市漢濱區張灘鎮；

高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器

氣相色譜質譜聯用儀：GCMS-QP2010型，日本島津公司；

氣相色譜儀：Agilent 7890A型，配Agilent DB-5氣相毛細管色譜柱，美國Agilent公司；

微量冷凍高速離心機：Thermo Legend Micro17R型，美國Thermo公司。

1.3 試劑

石油醚、無水硫酸鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、冰乙酸：分析純，天津市天力化學試劑有限公司；

硝酸鋁：分析純，天津市百世化工有限公司；

槲皮素：標準品，國藥集團化學試劑有限公司；

無水葡萄糖：標準品，大連美侖生物技術有限公司；

甲醇、乙醇、三氯甲烷：色譜純，天津益仁達化工有限公司。

1.4 方法

1.4.1 發酵工藝 桑葚清洗后瀝干，粉碎后全果漿發酵。桑葚果酒發酵工藝條件：發酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。發酵總時間為24 d。每3 d測1次，平行測3次，取平均值。

1.4.2 總糖含量的測定 采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)[11]。

1.4.3 總酸含量的測定 用鄰苯二甲酸氫鉀作基準物質標定NaOH溶液。發酵型桑葚果酒12 000 r/min離心10 min后，移取上清液2 mL至離心管。用NaOH標準溶液進行滴定，利用pH計來調節終點電位與預控電位。滴定終點電位是8.3[12]。記錄此時消耗的氫氧化鈉的體積。按式(1)計算發酵型桑葚果酒總酸含量。

(1)

式中：

s——總酸含量，g/L；

c——NaOH標準溶液濃度，g/mL；

k——檸檬酸系數[13]104；

v1——NaOH標準溶液消耗體積，mL；

v2——發酵型桑葚果酒上清液取樣體積，L。

1.4.4 總黃酮的測定 采用聚酰胺吸附—硝酸鋁顯色法[13]105，以槲皮素為標準品[14]繪制標準曲線。

1.4.5 乙醇含量的測定 采用氣相色譜法[15]。GC條件：DB-5氣相毛細管色譜柱(30 m× 320 μm，0.25 μm)；進樣口溫度220 ℃；分流進樣，分流比為20∶1；程序升溫，40 ℃保持4 min，然后以3.5 ℃/min升至50 ℃，再以25 ℃/min升至200 ℃；檢測器FID，檢測器溫度220 ℃，氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量11.5 mL/min；恒流模式，流速0.5 mL/min。

制作標準曲線：精密量取乙醇標準品稀釋，使濃度分別成為0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列對照品溶液，進樣量1 μL，測定峰面積，按內標法以峰面積計算。

每個果酒樣品取200 μL，用純水稀釋至10 mL后過濾上樣，進樣量1 μL。故計算時的稀釋體積為50倍，每個樣品處理2次分別進單針得到結果。

1.4.6 香氣成分的檢測 參考文獻[13]128-129。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖含量的測定線性關系

葡萄糖標準液的濃度為1 mg/mL，以標準液的濃度0.000，0.008，0.016，0.024，0.032，0.04，0.048 mg/mL為橫坐標，以其對應的吸光值(OD值)為縱坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程為Y=14.179X-0.000 7(R2=0.994 4)，表明在濃度范圍內線性關系良好。

2.2 乙醇的測定線性關系考察

精密量取乙醇溶液，并進行稀釋，使濃度分別成為0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mL/100 mL的系列對照品溶液，進樣，測定。以乙醇體積百分比(X)對峰面積積分值(Y)進行線性回歸，得回歸方程y=2 669.819 277 0x+1.404 216 9,R2=0.999 978 1。乙醇標準品氣相色譜圖、桑葚果酒色譜圖分別見圖1、2。

2.3 槲皮素的測定線性關系考察

槲皮素標準品濃度為424.0 μg/mL，以標準品的濃度(0.00，8.48，16.96，25.44，33.92，42.40，50.88，59.36 mg/L)為橫坐標，以其對應的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.007 2X-0.002 3(R2=0.999 7)，表明在濃度范圍內(8.48～59.36 mg/L)線性關系良好。

2.4 桑葚果酒發酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮動態測定

桑葚果酒發酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮動態測定結果見圖3。

由圖3看出，發酵過程中總糖含量處于先迅速下降后趨于平緩的過程。發酵最初9 d糖的消耗量最大，最后慢慢趨于平緩。桑葚果酒發酵過程中，總酸含量變化呈現上升趨勢，達到最大值后趨于相對穩定。在發酵第15～18天時樣品的總酸含量介于5～6 g/L，第24天達到6.61 g/L。桑葚果酒總黃酮從發酵第15天的 274.83 mg/L增長到發酵第21天的最大值(417.19 mg/L)。

圖1 乙醇標品色譜圖

圖2 桑葚果酒色譜圖

2.4.1 總糖含量的變化 桑葚果漿中總糖是釀酒酵母菌生長所需的碳源。總糖的消耗量間接反映釀造過程酵母菌生長速度的變化歷程。在桑葚果酒發酵最初階段，酵母菌活性較好，大量消耗了試驗中加入的蔗糖和桑葚本身所含的糖分。隨著時間的推移，酵母菌活性不斷下降，酵解速度趨于平緩，直至發酵完全。研究[16]38-39報道桑椹果酒發酵初始糖濃度會影響菌種對數生長期的出現時間。在桑葚汁初始糖濃度為180～280 g/L時，隨桑椹果酒發酵初始糖濃度的增加，酵母菌對數生長期的出現時間會推遲。高濃度的初糖會阻遏乙醇脫氫酶產生，對果酒發酵有抑制作用，同時導致高滲透壓，不利于酵母菌的生長。初糖濃度為180 g/L時桑葚汁釀造過程中釀酒酵母對數成長期在發酵第3天。本款桑葚果酒釀造初始糖濃度為202.78 g/L，發酵第3天降至35.10 g/L，表現出發酵第7天果酒總糖消耗最大。文獻[6]報道桑葚果酒發酵第9天，桑葚果酒中的還原糖含量降低至原來的5%，降至發酵最低水平。

溫度是發酵工藝控制的重要參數。桑葚果酒發酵溫度多推薦在20 ℃左右[8,10]。酵母菌的接種量也是決定酵母菌是否能快速成為發酵優勢菌的關鍵因素。接種量過少會導致發酵過程緩慢，釀造周期偏長；接種量過高會導致發酵過程過于迅速，不容易積累目標代謝產物。研究[17]報道最適的酵母接種量為5.00～7.00 g/L。本次發酵工藝參數中發酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g。在此工藝條件下，發酵1周后桑葚果酒總糖含量降低明顯，最終桑葚果酒中殘糖為(3.27±0.006) g/L。

圖3 桑葚果酒發酵過程中總糖、總酸、乙醇、總黃酮含量變化

2.4.2 乙醇含量的變化 從發酵開始到第3天，乙醇濃度快速升高。果酒發酵至第15天乙醇含量迅速升高，于第18天達到新的平臺值。在本款桑葚果酒發酵工藝條件下，乙醇的動態變化曲線呈現“S”型的特點。這可能與15.3 ℃ 發酵溫度，低于釀酒酵母菌生長的最適溫度20 ℃，導致最初發酵速度緩慢有關。在果酒發酵過程中，乙醇的大量積累會嚴重影響酵母細胞的生長，通過影響細胞形態、生理活動以及酶活性對酵母細胞產生脅迫。本款桑葚果酒釀造工藝由于最初發酵速度緩慢，乙醇濃度尚未對酵母菌的生長、發酵產生明顯的反饋抑制，在發酵第18～24天乙醇含量穩定在14%左右。

2.4.4 總黃酮含量的變化 發酵過程中，桑葚果實中的黃酮逐漸釋放，在微生物作用下大部分黃酮苷被降解為苷元，并溶于果酒中。

2.5 發酵型桑葚果酒的香氣成分分析

桑椹果酒GC-MS所得到的總離子流圖見圖4、5。圖中峰形、離子豐度和分離度均較好，滿足分析的要求。將分離得到的單組份色譜峰對應的質譜圖與NIST11譜庫中質譜圖進行檢索匹配，分離得到的所有組分對應質譜檢索相似度匹配率均>80%，鑒定結果列于表1、2中。

發酵第18天桑葚果酒香氣成分檢測到的醇類物質有10種，相對含量占43.5%；酸類物質有9種，相對含量占25.0%；酯類物質有8種，相對含量占16.1%；醛酮類物質相對含量占13.8%；3-烯丙基-6-甲氧基苯酚相對含量占1.6%。發酵第24天桑葚果酒香氣成分檢測到的醇類物質有7種，相對含量占34.5%；酸類物質有9種，相對含量占31.1%；酯類物質有6種，相對含量占12.7%；醛酮類物質相對含量占8.1%；高絲氨酸相對含量占7.7%；烷類物質相對含量占5.8%。其中有因具備愉快氣味成為酯類香料的物質，如丁二酸二乙酯；呈椰子和鳶尾似香氣和甜蜂蠟似風味的十四酸乙酯；呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣十六酸乙酯；呈鮮花香氣的十八烯酸乙酯；略呈蠟香的十八酸乙酯。可以被用作食用香料的酸類物質如2-甲基丁酸、丁酸、己酸、苯甲酸、棕櫚酸。3-羥基-2-丁酮被高倍數稀釋后會產生香甜的奶香氣，在酒類調香中占有重要地位。甘油醛是酵母菌糖酵解過程產生的中間代謝物，有一定的甜味，作為風味物質。莽草酸既可以作為保香物質，還具備一定藥用活性。該物質通過影響花生四烯酸代謝，發揮抑制血小板聚集作用，從而抑制動、靜脈血栓形成。亞油酸乙酯和亞油酸，尤其是亞油酸乙酯，均具備降低膽固醇和血脂的作用，對動脈粥樣硬化癥有預防保健作用。未檢測到酒香酵母菌產生的具有馬廄味的4-乙基苯酚，脂肪臭味的異戊酸等影響果酒香氣的成分。

圖4 桑葚果酒發酵第18天香氣成分GC-MS總離子流色譜圖

圖5 桑葚果酒發酵第24天香氣成分GC-MS總離子流色譜圖

比較第18天和第24天果酒香氣成分，均以醇類和酸類構成香氣成分的主體，其中酯類含量相對較少。第24天果酒香氣成分相較第18天，醇類物質相對含量降低，酸類物質相對含量增高，酯類物質相對含量降低。發酵第18天果酒中含有正己醇和異丁醇2種高級醇，相對含量較少，可以賦予發酵型桑葚果酒芳香氣味，提供豐富飽滿的口感。北京、河北、云南不同產地桑葚釀造的果酒香氣成分分析報道中，不同產地的桑葚果酒香氣成分醇、酸、酯之間的比例差異較大[18]。本次發酵工藝條件下，桑葚果酒香氣成分醇、酸、酯之間的比例與文獻[18]報道的河北產地桑葚果酒比較接近。氣相色譜-質譜聯用技術因其所具有的強大富集、分離和定性能力成為桑葚果酒香氣成分鑒定領域最有效的分析手段。目前，樣品前處理方法主要選用溶劑萃取法和頂空固相微萃取法。在檢索到的桑椹果酒香氣成分文獻中，桑葚果酒香氣成分差異較大。桑葚原材料、酵母菌種、發酵工藝、陳釀時間等因素的不同均會導致桑葚果酒香氣成分的檢測結果出現差異。一方面是參與貢獻桑葚果酒香氣的醇類、醛酮類、酯類、酸類、苯環及酚類、烷類各自所占百分比不同。另外，每款果酒的主要香氣成分組成也存在差異，除苯乙醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯外，其他組分各不相同。在檢索到的桑葚果酒香氣成分文獻中[13]126-128[18-19]，被重復檢測到的醇類物質包括2-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、苯乙醇、苯甲醇、己醇、壬醇、2，3-丁二醇；被重復檢測到的酸類物質包括己酸、乙酸、2-甲基丁酸、癸酸、油酸；被重復檢測到的酯類物質包括乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、棕櫚酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、辛酸乙酯。對照桑葚汁香氣成分[13]122-124[18-20]，同時在桑葚果汁和桑葚果酒中被重復檢測到的醇類物質包括苯乙醇、己醇；被重復檢測到的酸類物質包括己酸、乙酸、丁酸、亞油酸、棕櫚酸；被重復檢測到的酯類物質包括乙酸乙酯、十六酸乙酯、十四酸乙酯、癸酸乙酯、亞油酸乙酯、辛酸乙酯。

表1 桑葚果酒發酵第18天香氣成分分析

表2 桑葚果酒發酵第24天香氣成分分析

關于酒體香氣成分中乙醇的檢出，不同的文獻[19,21-22]報道結果有差異，文獻[19]檢測出桑葚果酒中的乙醇，其他均未報道。這可能與樣品的前處理方法以及和質譜檢測的動態范圍有關，含量達不到或者超過檢測范圍均不被檢測到。

3 結論

從桑葚果酒發酵主要成分動態變化規律來看，在發酵溫度15.3 ℃、接種量8.00 g/L、蔗糖加入量12.80 g/100 g的工藝條件下，發酵總時間可以縮短到18 d，果酒中殘存的總糖、總酸、乙醇含量均在較佳范圍，但總黃酮處于上升期，尚未到達最大值。本款發酵型桑葚果酒醇類和酸類構成香氣成分的主體，其中酯類含量相對較少，賦予了本款發酵型桑葚果酒主要香氣特征。