小米谷蛋白及醇溶蛋白結構特征

姬中偉戴甜甜毛 健

(1. 江南大學糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

谷子是中國北方的主要糧食作物之一[1]，脫殼后為小米。小米的各種營養素比例適宜，是一種良好的營養源[1]。相比稻米和小麥，小米中的碳水化合物含量比例不高，約為60%～70%[2]，小米中蛋白質的消化率為83.4%，生物價為57，高于大米和大麥[3]，同時，小米蛋白也是一種優良蛋白質的供應源，可應用于食用蛋白、營養強化劑及食品添加劑等多個食品領域[4]。小米蛋白經酶解處理后得到的多肽具有抗氧化性等功效[5-6]。古世祿等[7]指出絕大多數谷子品種蛋白質含量為10.00%～13.99%。小米中蛋白質具有低過敏性的優良特點，主要分布在小米的胚和胚乳中[8]，基本組成有以下四類蛋白：清蛋白、球蛋白、醇蛋白和谷蛋白[9]。魏益民等[10]采用Osborne法提取小米蛋白，結果顯示醇溶蛋白和堿溶蛋白所占比例分別為46.0%和21.2%，相對而言，清蛋白和球蛋白含量較低，二者共占5.5%。小米蛋白的提取有堿法和鹽法[11]，楊樺等[12]采用超聲波輔助酶法提取小米蛋白，使得提取率明顯提高。然而目前針對小米蛋白結構特性(如蛋白質二級結構組成、蛋白表面形態等)的研究較為缺乏，未見國內外相關文獻報道。

本試驗擬采用堿提酸沉法提取小米谷蛋白，并用乙醇提取小米醇溶蛋白[13-14]，然后對得到的2種蛋白的分子量分布及結構特征進行研究，為小米蛋白的進一步深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃小米：沁黃2號沁州，山西沁州黃小米(集團)有限公司；

無水乙醇、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨、氯化鋇、氯化鈉、硝酸銀等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：EL3002型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

低速大容量多管離心機：RJ-LDL-50G型，無錫市瑞祥分析儀器有限公司；

pH計：FiveEasy Plus型，范圍為0.08～14.00，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

高速粉碎機：DFY-300型，溫嶺市林大機器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

膠體磨：MF-50型，杭州惠合機械設備有限公司；

各劑量組實驗中期及實驗結束前采尾血測定各劑量組血常規各項血液學指標（血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數及其分類）。結果與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05)，且各項指標均在本實驗室正常值范圍內。

高壓均質機：NS2006L型，德國GEA集團；

圓二色光譜儀：MOS-450型，美國Biologic公司；

原子力顯微鏡：Demension ICON型，德國布魯克科技有限公司；

冷凍干燥機：BETA 2-8-LD plus型，德國Christ公司；

X射線衍射儀：D2 PHASER型，德國布魯克AXS有限公司；

電泳儀：Mini-PROTEAN?Tetra型，美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 小米脫脂 稱取500 g小米，用粉碎機充分粉碎后過50目篩，稱量，室溫下用1∶2 (g/mL)的正己烷攪拌浸泡4 h，用保鮮膜密封，脫去脂肪，重復1次。將脫脂后的小米在空氣中干燥12 h，于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 小米蛋白的提取

(1) 小米谷蛋白的提取： ① 取300 g脫脂后的小米按1∶15 (g/mL)比例加入蒸餾水，用膠體磨在2 800 r/min轉速下處理2次，磨齒間隙為5 μm，然后在40 MPa壓力下循環均質1 h；② 用0.5 mol/L NaOH調節pH 8.5～8.8，攪拌30 min，靜置4 h；③ 所得上清液用0.5 mol/L HCl調節pH 4.5，靜置30 min后，于5 000 r/min離心15 min，沉淀水洗2次，冷凍干燥后-20 ℃保存備用。

(2) 小米醇溶蛋白的提取：將1.2.2(1)中第2步靜置后所得的沉淀按1∶6 (g/mL)加入體積分數65%乙醇在35 ℃條件下攪拌浸提4 h，4 500 r/min離心20 min得上清液，向上清液中緩緩加入鹽水，同時攪拌，直至體積達到原上清液的3倍，溶液中氯化鈉濃度達到0.3 g/100 g。于0～4 ℃環境下放置1 d，使醇溶蛋白沉淀析出來，并使用8～12 kDa透析袋將沉淀透析除鹽，處理時間為1 d，透析液為去離子水。透析過程中經常更換透析液，直到向其中加入AgNO3溶液后沒有明顯的白色沉淀物出現為止，蛋白沉淀經冷凍干燥后在-20 ℃保存待用。

(3) SDS-PAGE分析：參考Laemmli[15]報道的方法并略做修改。采用Biosharp凝膠制備試劑盒，制備濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，取1 g/L蛋白樣品100 μL和SDS-PAGE樣品緩沖液25 μL于500 μL離心管中，煮沸處理1 min，5 000 r/min離心1 min。吸取20 μL上清液開始進樣，在室溫下電泳處理，將濃縮膠中電壓恒定為100 V，電泳過程中注意觀察樣品，當前端到達分離膠時，將電壓增加為150 V。電泳結束后，采用考馬斯亮藍染色處理膠片，用去離子水脫色。

(4) 圓二色光譜分析(CD)：參考趙小莉等[16]的分析方法并稍加修改。稱取一定量的谷蛋白和醇溶蛋白，用65%乙醇溶解醇溶蛋白配制成1 mg/mL蛋白溶液，谷蛋白加水溶解使其濃度為1 mg/mL，并調節pH 12.0。采用圓二色光譜儀在遠紫外區域(190～250 nm)掃描，光譜間隔0.1 nm，掃描速度為50 nm/min。所得數據經Origin 8.0進行擬合，針對以上2種蛋白質的二級結構在分析網站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml)上做模擬和分析。

(5) X射線衍射分析(XRD)：根據Guerrero等[17]和Naidja等[18]提供的方法稍作調整。利用D2 PHASER型X-衍射儀進行測定。相關參數：采用Cu Kα石墨單色器，電壓40 kV，掃描速度0.05°/s，掃描范圍3°～50°。

(6) 原子力顯微鏡分析(AFM)：根據耿勝榮等[19]報道的方法略微調整，將小米谷蛋白及醇溶蛋白分別溶于蒸餾水和65%乙醇中，配成50 μg/mL的蛋白溶液，攪拌過夜，靜置待不溶性顆粒沉淀，各取1滴上清液滴于新剝離的云母片(長和寬均為1.0 cm)上，待液體揮發晾干后備用。在制備樣品的過程中，應保證避免各種污染，同時確保掃描準確、探針清潔。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

小米醇溶蛋白與谷蛋白的SDS-PAGE鑒定見圖1。從圖1可以看到，分離得到的小米醇溶蛋白在11～25 kDa有3條明顯的條帶，由此判斷小米醇溶蛋白的分子量均在11～25 kDa；小米谷蛋白在11～180 kDa均有分布，且15～17 kDa 及25～35 kDa的條帶顏色較深，由此推斷此分子量范圍的小米谷蛋白含量較高。

a. 小米醇溶蛋白 b. 小米谷蛋白

2.2 圓二色光譜分析

190～240 nm紫外波段的CD圖譜能夠映射出生物大分子(如蛋白質等)的主鏈結構特征，能反應出包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲等二級結構的光譜疊加特性。據文獻[20]可知，在190 nm處存在正峰，同時在208，220 nm 處有負峰，則表明該分子具有α-螺旋構象；216 nm處呈負峰且185～200 nm存在正峰，表明有β-折疊構象；在206 nm處出現正峰意味著存在β-轉角構象；另外，在198 nm附近有負峰，220 nm處有小且較平的正峰，表明存在無規卷曲構象。醇溶蛋白和谷蛋白的CD擬合圖見圖2，利用分析軟件運算得到2種蛋白二級結構的相關數據，見表1。

α-螺旋和β-折疊反映的是蛋白質分子的有序性，β-轉角和無規則卷曲反映的是蛋白質分子松散程度。表1顯示，小米醇溶蛋白中α-螺旋含量>40%而β-折疊幾乎沒有，由此可以判斷小米醇溶蛋白屬于全α型[21]結構，相比于小米醇溶蛋白，小米谷蛋白的α-螺旋和β-折疊含量較少而β-轉角及無規則卷曲含量較多，由此可見小米醇溶蛋白的有序性優于小米谷蛋白。

1. 小米醇溶蛋白 2. 小米谷蛋白

%

2.3 X射線衍射分析(XRD)

采用X射線衍射技術研究小米醇溶蛋白與谷蛋白的晶體狀態及差異，結果見圖3、4。從圖3、4可以看到，醇溶蛋白與谷蛋白均沒有明顯增強的衍射峰，由此推斷2種分離蛋白是無定型的。

2.4 原子力顯微鏡分析(AFM)

圖5是小米醇溶蛋白及谷蛋白溶解液原子力顯微鏡的二維圖和三維圖。從圖5中能夠清晰地觀察到2種蛋白的聚集度及表面形態。小米醇溶蛋白呈分散狀態，顆粒大小較均勻，表面凸起平緩，直徑多在430～650 nm，最高高度只有8 nm；小米谷蛋白顆粒大小參差不齊，聚集度高，且表面凸起較高，最高高度有16.4 nm。結果表明，小米醇溶蛋白分布均衡且尺寸較小，而小米谷蛋白的大小多樣，且分布雜亂無序，與本試驗SDS-PAGE分析和CD分析結果一致。

圖3 小米醇溶蛋白XRD圖譜

圖4 小米谷蛋白XRD圖譜

圖5 小米醇溶蛋白及谷蛋白的AFM圖

3 結論

小米醇溶蛋白和谷蛋白在結構上存在較大差異。SDS-PAGE結果表明，小米醇溶蛋白在11～25 kDa有3條譜帶，17 kDa處譜帶明顯，而小米谷蛋白在高分子量和低分子量范圍內都有譜帶，由此可知小米醇溶蛋白的組成較為簡單，且分子量較小，而小米谷蛋白在高分子量和低分子量范圍內均有分布，且分子量為15～17 kDa和25～35 kDa的蛋白質含量較高。經XRD分析，小米中的醇溶蛋白和谷蛋白皆為無定型結構。圓二色光譜法測定了2種蛋白質二級結構，結果表明小米醇溶蛋白屬于全α型結構，有序性優于小米谷蛋白，此結果在原子力顯微鏡分析中也得以驗證。