人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測的臨床應用

軒乾坤，郭 建，吳文娟，李廣波

（同濟大學附屬東方醫院檢驗科，上海 200123）

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，發病率及死亡率在腫瘤中居第4位[1]。有研究結果表明，99.7%的宮頸癌發生與高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染直接相關，高危型HPV持續性感染是引起宮頸癌發生的必要因素[2-3]。HPV感染后其基因整合到宿主細胞基因組，并啟動癌基因E6、E7的表達。HPV E6、E7是導致宮頸癌變發生和發展的重要因素[4]，檢測HPV E6、E7 mRNA的表達對于宮頸癌的篩查具有重要意義。為此，本研究評價了HPV E6/E7 mRNA在臨床HPV感染篩查中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年7月—2017年4月同濟大學附屬東方醫院婦科門診就診的患者5 308例，年齡22～65歲。所有患者均進行宮頸細胞學檢測，同時進行HPV DNA檢測或HPV E6/E7 mRNA檢測。就診原因：白帶增多、性生活后出血、異常陰道出血及體檢異常等。

1.2 方法

1.2.1 液基薄層細胞學（thinprep cytologic test，TCT）檢測 所有對象均選擇非月經期，將采集的宮頸脫落細胞裝入裝有細胞保存液的小瓶中，送至病理科，由病理科出具檢驗報告，診斷標準參照國際癌癥協會推薦的TBS（2001）分類標準，分為正常或炎癥、低度鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）、高度鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）、鱗狀細胞癌和腺癌（adenocarcinoma，CA）、意義不明的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASCUS）。

1.2.2 HPV DNA檢測 采用cobas 4800全自動HPV樣本制備和檢測平臺（瑞士羅氏公司）檢測HPV DNA。該儀器檢測原理是基于實時熒光定量聚合酶鏈反應的多通道核酸檢測，以β球蛋白的管家基因為內對照，1次檢測可報告HPV16型、18型和其他12種高危HPV亞型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68b）不分型的陰、陽性結果。

1.2.3 HPV E6/E7 mRNA檢測 采用新柏氏液體細胞學采樣瓶留取標本，采用PANTHER系統（美國HOLOGIC Gen-Probe公司）及APTIMA HPV E6/E7 mRNA高危和分型試劑檢測HPV E6/E7 mRNA。該系統的檢測原理是基于轉錄介導的擴增技術（transcription-mediated amplification，TMA）和雙動力化學發光技術。第1步檢測14個高危型，報告陰、陽性，陽性標本進行第2步的分型檢測，報告HPV16型、HPV18/45型；如第1步檢測陽性，第2步檢測陰性則報告其他11個高危HPV亞型（31、33、35、39、51、52、56、58、59、66和68）不分型的陽性結果。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA初篩陽性率的比較

5 308 例患者中有4 062例檢測了HPV DNA，有1 246例檢測了HPV E6/E7 mRNA。HPV DNA初篩陽性率[17.67%（718/4 062）]明顯高于HPV E6/E7 mRNA[12.12%（151/1 246）]（P＜0.05）。

2.2 各組HPV DNA和HPV E6/E7mRNA陽性率的比較

根據TCT檢測結果將5 308例患者分為4個組：正常組（4 976例）、ASCUS組（231例）、LSIL組（69例）、HSIL組（32例）。HSIL組、LSIL組及ASCUS組HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；正常組HPV DNA陽性率（15.07%）明顯高于HPV E6/E7 mRNA陽性率（8.90%）（P＜0.05）。見表1。

2.3 HPV DNA、HPV E6/E7mRNA陽性者中各組所占比例的比較

表1 正常組、ASCUS組、LSIL組、HSIL組HPV DNA、HPV mRNA陽性率比較

718例HPV DNA陽性者中正常組574例（79.95%）、ASCUS組82例（11.42%）、LSIL組40例（5.57%）、HSIL組22例（3.06%）。151例HPV E6/E7 mRNA陽性者中，正常組104例（68.88%）、ASCUS組24例（15.89%）、LSIL組15例（9.93%）、HSIL組8例（5.30%）。HPV DNA陽性者各組比例與HPV E6/E7 mRNA陽性者各組比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

以LSIL和HSIL為細胞病理學陽性，以正常和ASCUS為細胞病理學陰性。HPV E6/E7 mRNA陽性者中細胞病理學陽性患者的比例[15.23%（23/151）]明顯高于HPV DNA陽性者中細胞病理學陽性患者的比例[8.64%（62/718）]（P＜0.05）。

2.4 HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA篩查LSIL和HSIL的敏感性和特異性

以LSIL和HSIL為細胞病理學陽性，以正常和ASCUS為細胞病理學陰性，計算HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA篩查LSIL+HSIL的敏感性和特異性。HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA 篩查LSIL+HSIL的敏感性分別為83.78%和85.19%，二者差異無統計學意義（P＞0.05）；特異性分別為83.55%和89.49%，二者差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

目前，隨著HPV高危型與宮頸癌發病相關性研究的深入，HPV分型檢測越來越受到關注。HPV持續感染是宮頸癌及其癌前病變發生、發展的必要條件。檢測高危型HPV的持續感染可以輔助宮頸癌及其癌前病變的早期診斷和治療。美國陰道鏡及宮頸病理協會在其宮頸癌篩查指南中建議30～65歲的女性應把HPV分型檢測和宮頸細胞病理學檢測作為篩查策略[5]。

有研究結果表明，HPV DNA陽性者中有絕大多數是HPV一過性感染，約70%～80%的女性在一生中有可能感染HPV，其中有90%的感染者可在8～24 個月內自然清除，只有高危型HPV的持續性感染才有可能導致宮頸病變或宮頸癌[6-8]。HPV感染后，HPV DNA基因整合到宿主細胞染色體中，E6/E7表達的癌基因蛋白有抑制抑癌蛋白p53和Rb的功能，影響感染細胞的生長周期，導致細胞向癌變方向發展[9-10]。HPV E6/E7 mRNA是與宮頸癌進展相關的mRNA，如未檢出mRNA轉錄物說明病毒仍處于游離或休眠狀態；而高頻率的E6/E7 mRNA轉錄活動說明高危型HPV已整合入宿主基因并干擾細胞周期控制，導致LISL和HSIL的發生。本研究結果顯示，HPV DNA篩查陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA篩查陽性率。正常組HPV DNA陽性率明顯高于HPV E6/E7 mRNA陽性率，表明部分HPV感染者尚未引起宿主細胞的病理改變。ASCUS組、LSIL組、HSIL組HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率差異無統計學意義（P＞0.05），與文獻報道[11]一致。

TCT陽性是患者進行陰道鏡檢測和宮頸病理活檢的重要依據。本研究以TCT結果（LSIL+HSIL為細胞病理學陽性，正常+ASCUS為細胞病理學陰性）為評價標準，計算HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA篩查LSIL+HSIL的敏感性和特異性。結果顯示，HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA 篩查LSIL+HSIL的敏感性一致（P＞0.05），但HPV E6/E7 mRNA的特異性優于HPV DNA（P＜0.05）。HPV E6/E7 mRNA陽性者中細胞病理學陽性患者的比例[15.23%（23/151）]明顯高于HPV DNA陽性者中細胞病理學陽性患者的比例[8.64%（62/718）]（P＜0.05）。由此可見，HPV E6/E7 mRNA陽性提示細胞病變的特異性更高。NOLTE等[12]的研究結果顯示，與TCT相比，HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA的敏感性和特異性均較高，更適合于宮頸癌的初篩。還有研究結果顯示，對于宮頸上皮內瘤變患者治療后的隨訪，采用HPV E6/E7 mRNA檢測可有效評估復發風險[13-14]。

臨床上HPV篩查的目的并不僅僅是為了檢測HPV感染，還要發現宮頸癌高風險人群，進而決定哪些人不需要進行進一步的治療并回歸常規人群管理。HPV E6/E7 mRNA是有致癌作用的mRNA，故與HPV DNA檢測相比，可有效減少HPV一過性感染的檢出并有較好的預測價值，從而減少不必要的陰道鏡組織學檢查，并減輕患者不必要的心理壓力，降低醫療費用。