梅毒螺旋體特異性抗體檢測方法在血清學診斷中的應用評估

莊亦暉，龔 燕，許曉峰，盧仁泉，高 翔，郭 林

（復旦大學附屬腫瘤醫院檢驗科 復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032）

梅毒是一種嚴重危害人體健康的性傳播疾病，現已成為全世界顯著的公共衛生問題之一[1]，其病原體為梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）。目前，TP尚不能在體外培養，因此測定血清中的TP抗體就成為臨床診斷梅毒感染的主要途徑。血清學診斷方法主要分為2類：第1類為非TP抗原血清試驗，檢測的是針對類脂抗原的抗體，即反應素，常用方法有性病研究實驗室試驗、快速血漿反應素環狀卡片（rapid plasma reagin，RPR）試驗、甲苯胺紅不加熱血清試驗（tolulized red unheated serum test，TRUST）等；第2類為TP抗原血清試驗，檢測的是TP的特異性抗體，主要有梅毒螺旋體血凝試驗、梅毒螺旋體明膠凝集試驗（Treponema pallidum particle assay，TPPA）、熒光密螺旋體抗體吸附試驗、酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）、免疫層析法、化學發光法（chemiluminescence immunoassay， CLIA）及免疫印跡法等。如果第1類試驗有反應性，需經第2類試驗證實，以排除假陽性。本研究擬評估免疫層析法和化學發光微粒子免疫分析法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）在檢測TP特異性抗體中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

350份血清樣本均來自復旦大學附屬腫瘤醫院門診及住院術前檢查患者，其中男性樣本194例、女性樣本156例，年齡45~67歲。

1.2 儀器與試劑

TPPA試劑購自日本伯樂富士瑞必歐株式會社。Determine Syphilis TP抗體膠體硒法試劑（免疫層析法）購自美國雅培公司。ARCHITECT Syphilis TP試劑（CMIA）購自美國雅培公司，檢測儀器為ARCHITECT i2000SR全自動化學發光免疫分析儀（美國雅培公司）。免疫印跡法試劑購自歐蒙醫學診斷（中國）有限公司。TRUST試劑購自上海榮盛生物有限公司。

1.3 方法

350份樣本首先采用TPPA和TRUST測定，然后采用免疫層析法和CMIA平行檢測，2種方法檢測結果不一致的樣本再用免疫印跡法復核。所有操作和結果判讀均嚴格參照試劑和儀器說明書。免疫層析法以檢測試紙條上質控線和檢測線均出現為樣本有反應性。CMIA以相對發光值（relative light unit，RLU）與校準品臨界值的比值（S/CO）報告，S/CO≥1.0為樣本有反應性。根據TPPA檢測結果分組：第1組125份樣本，為TPPA有反應性；第2組25份樣本，為TPPA 1∶80弱反應性；第3組200份樣本，為TPPA陰性。第1組和第2組合計150份樣本用于方法敏感性評價。第3組200份樣本用于方法特異性評價。

1.4 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0版進行統計分析。數據以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

第1組和第2組150份樣本中，免疫層析法檢出有反應性樣本145份，5份未檢出（樣本號為1～5號），敏感性為96.7%（145/150）；CMIA檢出有反應性樣本150份，敏感性為100.0%（150/150），2種方法的敏感性差異無統計學意義（χ2=3.3，P＞0.05）。第3組200份樣本中，免疫層析法檢出弱反應性樣本8份（樣本號為6～13號），CMIA檢出有反應性樣本16份（樣本號為6、7、10、11、13～24號）。免疫層析法與TPPA有13份樣本的檢測結果不一致，2種方法的一致率為96.3%（337/350）；CMIA與TPPA有16份樣本的檢測結果不一致，2種方法的一致率為95.4%（334/350）。見表1。

對24份檢測結果不一致的樣本采用免疫印跡法進行復核。第1組和第2組中免疫層析法未檢出的5份樣本（樣本號為1～5號）免疫印跡法結果均為有反應性，其中1、3、5號樣本在TpN47條帶處顯示較淡條帶。在第3組免疫層析法有反應性的8份樣本（樣本號為6～13號）中，7號和10號樣本的免疫印跡法結果為有反應性；在CMIA有反應性的16份樣本（樣本號為6、7、10、11、13～24號）中，7、10、17、21和23號樣本的免疫印跡法結果為有反應性，但這5份樣本缺乏臨床信息來支持疾病的進一步明確診斷，為不確定結果，需要今后跟蹤隨訪，因此這5份暫不作為陰性樣本；此外，6、13、14、16、18和20號樣本的免疫印跡法結果為臨界，作為陰性結果處理。因此，最終校正后的方法特異性如下：免疫層析法的特異性為98.5%（192/195），CMIA的特異性為94.4%（184/195），2種方法的特異性差異無統計學意義（χ2=3.6，P＞0.05）。見表2、表3。

表1 免疫層析法和CMIA的檢測結果

表2 24份檢測結果不一致樣本的免疫印跡法結果

續表2

表3 24份檢測結果不一致樣本的免疫印跡法結果匯總

3 討論

在過去30多年中，TP細胞壁脂蛋白的分離與提純以及基因重組技術的出現，使TP的實驗室檢測技術飛速發展，其中最常見的4個用于TP特異性抗體檢測的特異性多肽是TpN15、TpN17、TpN45和TpN47[2]。本研究評估的免疫層析法和CMIA包被抗原中均包含TpN47。TpN47具有免疫原性強、誘導早期體液免疫及其抗體存在于未治療梅毒的各個階段等特點[3]。

本研究結果顯示免疫層析法的敏感性和特異性分別為96.7%、98.5%；CMIA的敏感性和特異性分別為100.0%、94.4%，2種方法的敏感性和特異性差異均無統計學意義（P＞0.05），可以滿足不同實驗室的檢測需求。

在敏感性方面，CMIA檢測出了所有TPPA有反應性和1∶80弱反應性的樣本，顯示出很高的敏感性，與文獻報道[4-5]一致。這可能與其試劑中聯合包被3種重組抗原（TpN15、TpN17、TpN47）有關，與免疫層析法試劑僅包被TpN47抗原相比，更廣的抗原譜提升了對TP特異性抗體的檢測能力。免疫層析法未檢出的5份TPPA有反應性的樣本，免疫印跡法均出現了2條以上的特異性條帶，結果為有反應性，其中有3份樣本的TpN47條帶較淡，因此樣本中相應抗體的濃度較低。由此推測這5份樣本均有可能是因為抗體濃度過低、降低了抗原抗體反應的強度而導致免疫層析法出現假陰性結果。

在特異性方面，CMIA在梅毒低危人群中有一定比例的假陽性。這種現象最先由美國疾病預防控制中心報道：在梅毒低危人群中，如ELISA或CLIA檢測TP特異性抗體有反應性，但RPR試驗或TRUST檢測無反應性且TPPA也無反應性，則可排除TP感染[6-7]。出現這種假陽性現象的原因至今不甚明了，有可能是體內共生螺旋體產生的交叉抗體[8]。本研究結果顯示，在去除免疫印跡法結果為臨界的5份樣本后，在其他195份TPPA無反應性樣本中，CMIA有11份樣本（5.6%）可能為假陽性結果，這11份樣本免疫印跡法結果為6份可疑、5份陰性；免疫層析法有4份樣本為弱反應性，其中3份樣本的免疫印跡法結果出現單條TpN47條帶，確切原因未知。BAKER-ZANDER等[9]的研究結果顯示，正常人血清中可存在少量與TpN47發生反應的免疫球蛋白。這可能是免疫層析法出現弱反應性的原因之一。

聯合國開發規劃署、世界銀行、世界衛生組織的性傳播疾病診斷規劃組對6種檢測TP特異性抗體的快速診斷產品的聯合評估結果顯示，免疫層析法的敏感性和特異性分別為97.2%、94.1%[10]，與本研究結果相似。因免疫層析法具有操作簡便、結果直觀、可采用全血進行檢測的特點，所以被世界衛生組織推薦至疾病高發地區或發展中國家的基層診所或實驗室進行進一步評估。由此可見，在梅毒高發人群中可以先用免疫層析法進行篩查，并結合TRUST或RPR試驗確定患者是否為新發感染。SIEDNER等[11]采用免疫層析法檢測了梅毒高風險患者的全血樣本，結果顯示敏感性和特異性均為100% 。

篩查TP感染以往最普遍的方法是TRUST或RPR試驗，考慮到其生物假陽性現象，需用TPPA加以確認，而基層醫療機構中往往因樣本量少以及試劑、儀器、人員、技術等因素而不開展TPPA，因此更趨于選擇對操作者技術要求不高的免疫層析法。在大型綜合性醫院、專科醫院以及采供血醫療機構中，日益增加的樣本量使得以手工操作為主的TPPA面臨嚴峻挑戰，而可以實現自動化操作的ELISA和CLIA能滿足實驗室高通量檢測的需求，因此TP的實驗室篩查逐漸由傳統流程轉向反向流程[12]。

綜上所述，免疫層析法具有操作簡便、無需額外儀器，獲取結果時間短的優點，適用于基層醫療機構和邊遠地區的產前篩查。CMIA具有高通量、數據易于保存等諸多優點，在梅毒反流程篩查方案中可作為一線篩查試驗，適用于樣本量大的大型實驗室。總之，CMIA、免疫層析法具有很好的敏感性和特異性，且與TPPA具有較好的一致性，可用于臨床檢測。