多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)模型在肺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

張海晨，王 浩，宋云霄，馬 進(jìn)

（1. 上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200031；2.江西省精神病院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330029；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，上海 200025）

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。50年以來，肺癌5年生存率僅提升了4%，其主要原因是檢出滯后，而及早診斷和治療可顯著提高患者的生存率[1]。腫瘤標(biāo)志物可用于腫瘤的篩查、診斷和預(yù)后判斷等，但單個(gè)腫瘤標(biāo)志物的敏感性或特異性不高，難以滿足臨床要求，因此臨床實(shí)踐中提倡多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，以提高診斷敏感性和特異性。目前，用于肺癌檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物主要有糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）、腫瘤胚胎抗原、分化抗原和增生抗原等。盡管腫瘤標(biāo)志物在腫瘤的診斷、療效評(píng)價(jià)和隨訪觀察方面價(jià)值巨大，但臨床上有大量腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)被不當(dāng)使用，從而造成醫(yī)療資源的巨大浪費(fèi)。合理、有效地應(yīng)用這些腫瘤標(biāo)志物，不僅可提高檢測(cè)的敏感性和特異性，也可避免過度醫(yī)療導(dǎo)致的資源浪費(fèi)。為此，本研究收集了肺癌患者的多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，建立多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)模型，為臨床檢驗(yàn)策略優(yōu)化提供一種可行方案。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年1月—2015年12月上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院收治的，經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性肺癌（primary lung cancer，PLC）的患者318例，其中男216例、女102例，年齡36～92歲，從中隨機(jī)選取280例（男187例，女93例）作為PLC組，其他38例患者用于驗(yàn)證運(yùn)算。選取同期上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院和上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院肺良性疾病（benign pulmonary disease，BPD）患者505例，其中男327例、女178例，年齡16～106歲，從中隨機(jī)選取455例患者（男302例，女153例）作為陰性對(duì)照，其他50例患者用于驗(yàn)證運(yùn)算。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對(duì)象空腹靜脈血，2 h內(nèi)離心分離血清。在24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的樣本冷藏（2～8 ℃）保存，24 h內(nèi)無法測(cè)定的樣本冷凍（-20℃及以下）保存，不能反復(fù)凍融，冷凍保存的樣本最多保存6個(gè)月。血清樣本量不少于5 mL。

1.2.2 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、CA125、CA15-3、CA19-9、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）、CA72-4、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）采用cobas e411全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測(cè)。腫瘤特異性生長因子（tumor specific growth factor，TSGF）采用酶法檢測(cè)，試劑盒購自廣州科方生物技術(shù)股份有限公司，檢測(cè)儀器為ADVIA 2400全自動(dòng)生化分析儀（德國西門子公司）。CA50和CA242采用MAGLUMI 800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司）及配套試劑（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。正態(tài)分布資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。采用Medcalc v11軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，并計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）、敏感性、特異性、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、Youden指數(shù)、最佳臨界值等參數(shù)。AUC比較采用Z檢驗(yàn)，AUC＜0.5時(shí)無診斷價(jià)值，0.5～0.7時(shí)診斷價(jià)值較低，0.7～0.9時(shí)診斷價(jià)值中等，＞0.9時(shí)診斷價(jià)值較高。應(yīng)用探索性因子分析（exploratory factor analysis，EFA）提取潛在公共因子，對(duì)同一因子內(nèi)的指標(biāo)用綜合評(píng)定法進(jìn)行篩選，多指標(biāo)擬合采用Logistic回歸分析，用主成分分析法消除多重共線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC組與BPD組12項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的比較

除TSGF外，PLC組CEA、CA15-3、CA72-4、CA242、CYFRA 21-1、CA125、CA19-9、CA50、SCC-Ag、NSE和AFP水平均明顯高于BPD組（P＜0.01）。見表1。

表1 PLC組與BPD組12項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物水平的比較

2.2 各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的ROC曲線分析

ROC曲線分析顯示，CA15-3、NSE、CA125、CEA、CYFRA 21-1、CA72-4的診斷價(jià)值為中等及以上（AUC≥0.7），TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCC-Ag的診斷價(jià)值一般（0.5≤AUC＜0.7）。在AUC≥0.7的腫瘤標(biāo)志物中，NSE的敏感性最高，且Youden指數(shù)最高，是診斷能力最強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物；CEA的特異性最高，且對(duì)疾病的判斷能力較強(qiáng)（+LR=6.67）。通過比較AUC可知，CA15-3、NSE、CA125、CEA和CYFRA 21-1的診斷能力相等（P＞0.05）；CA72-4、TSGF、CA19-9、CA242、AFP、CA50、SCCAg的AUC與CA15-3比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）。見表2。

2.3 多指標(biāo)聯(lián)合模型的建立與驗(yàn)證

2.3.1 提取公共因子 為提高診斷的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行因子分析時(shí)僅選取AUC≥0.6的腫瘤標(biāo)志物。此外，由于PLC組TSGF水平與BPD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此進(jìn)行因子分析時(shí)不納入TSGF。分別對(duì)PLC組和BPD組的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)化，將PLC組11項(xiàng)指標(biāo)標(biāo)化后的數(shù)據(jù)代入變量。選擇KMO和Bartlett球度檢驗(yàn)（設(shè)定特征值＞1，選擇四次方最大旋轉(zhuǎn)，選擇取消小系數(shù)并設(shè)值為0.5）。結(jié)果輸出為KMO=0.667、Bartlett球度檢驗(yàn)P＜0.001、方差累積貢獻(xiàn)率為100%，滿足EFA分析條件。旋轉(zhuǎn)后成分矩陣和旋轉(zhuǎn)后3D載荷圖顯示PLC組11項(xiàng)指標(biāo)被降維成4個(gè)公共因子，并按方差貢獻(xiàn)率大小順序排列。BPD組采用與PLC組同樣的方法進(jìn)行因子分析。結(jié)果輸出為KMO=0.687、Bartlett球度檢驗(yàn)P＜0.001、方差累積貢獻(xiàn)率為86%，滿足EFA分析條件。旋轉(zhuǎn)后成分矩陣和旋轉(zhuǎn)后3D載荷圖顯示BPD組11項(xiàng)指標(biāo)被降維成3個(gè)公共因子，并按方差貢獻(xiàn)率大小順序進(jìn)行排列。見表3、圖1。

PLC組中，CA242、CA50、CA125、CA19-9在公共因子1上具有較大的載荷系數(shù)，其中CA242、CA50和CA19-9為廣譜腫瘤標(biāo)志物，CA125為PLC相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[1]；CA72-4、CYFRA 21-1在公共因子2上具有較大的載荷系數(shù)，這2個(gè)腫瘤標(biāo)志物均對(duì)非小細(xì)胞肺癌（nonsmall-cell lung carcinoma，NSCLC）有較高特異性[1-4]；SCC-Ag、NSE在公共因子3上具有較大的載荷系數(shù)，這2個(gè)指標(biāo)分別對(duì)肺鱗癌（squamous cell lung carcinoma，SQLC）和小細(xì)胞肺癌（small-cell lung carcinoma，SCLC）有較高特異性[1-2，5-6]；CA15-3、CEA在公共因子4上具有較大的載荷系數(shù)，這2個(gè)指標(biāo)對(duì)肺腺癌（adenocarcinoma，ADC）和大細(xì)胞肺癌（large cell carcinoma，LCC）的特異性較高[1-2]。AFP由于在各個(gè)公共因子中的載荷系數(shù)均較小，因此被剔除。將上述4個(gè)因子作為PLC的診斷指標(biāo)，其中公共因子1診斷價(jià)值最高，可用于判斷陰陽性；公共因子2、公共因子3和公共因子4次之，在幫助診斷的同時(shí)，還有助于疾病的分型；肺癌診斷輔助因子可用于輔助疾病的鑒別診斷。BPD組被提取出3個(gè)公共因子，反映了各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)在正常人群中的分布情況及相關(guān)性。

2.3.2 擬建聯(lián)合模型 經(jīng)文獻(xiàn)檢索可知，11種腫瘤標(biāo)志物對(duì)肺癌均有診斷價(jià)值，但AFP、CA242、CA50和CA72-4的支持文獻(xiàn)較少[7-10]；而CA199、CA125、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag、CA15-3、CEA的文獻(xiàn)證據(jù)充分，且CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag和CEA被列入歐洲腫瘤標(biāo)志物學(xué)會(huì)（European Group on Tumor Markers，EGTM）[11]和美國臨床生化學(xué)會(huì)（the National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）[2]的指南中，推薦用于肺癌的診斷和分型。對(duì)公共因子1中的4種腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示CA242、CA50和CA19-9兩兩間呈強(qiáng)相關(guān)（P＜0.01）。CA19-9的診斷效能最優(yōu)，CA242的診斷效能與CA50差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此排除CA242和CA50，僅保留CA19-9。CA125與其他腫瘤標(biāo)志物呈弱相關(guān)（P＜0.01），其診斷效能顯著高于其他腫瘤標(biāo)志物（P＜0.01），見表4。對(duì)其他因子內(nèi)的指標(biāo)采用同一方法進(jìn)行篩選。在公共因子2中，CYFRA 21-1與CA72-4呈正相關(guān)（r=0.357，P＜0.01），兩者的診斷效能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此排除CA72-4，保留CYFRA 21-1。在公共因子3中，NSE與SCC-Ag無相關(guān)性（r=0.019，P＞0.05），兩者的診斷效能差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），均予以保留。在公共因子4中，CA15-3與CEA呈正相關(guān)（r=0.501，P＜0.01），兩者的診斷效能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，PLC組可由CA199、CA125、CYFRA 21-1、SCC、NSE、CEA、CA15-3組成聯(lián)合，標(biāo)記為PLC預(yù)測(cè)模型。

表2 12項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的診斷性能分析

表3 旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣

圖1 PLC組和BPD組旋轉(zhuǎn)后11項(xiàng)指標(biāo)的3D載荷圖

2.3.3 聯(lián)合模型診斷價(jià)值 設(shè)因變量，PLC組標(biāo)記為1，BPD組標(biāo)記為0，采用Logistic回歸分析。先進(jìn)行單因素分析，篩選出P＜0.1的變量，除AFP（P=0.355）外，其他10項(xiàng)指標(biāo)均滿足條件。設(shè)因變量，PLC組標(biāo)記為1，BPD組標(biāo)記為0，采用Logistic回歸分析，10項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物強(qiáng)制進(jìn)入?yún)f(xié)變量獲得預(yù)測(cè)概率（標(biāo)記為Pre-P10），其AUC為0.849。PLC預(yù)測(cè)模型（PLC預(yù)測(cè)模型標(biāo)記為1，與其對(duì)應(yīng)的BPD組指標(biāo)標(biāo)記為0，兩者的集合標(biāo)記為PLC-BPD）獲得預(yù)測(cè)概率（標(biāo)記為Pre-P7）的AUC為0.831，與Pre-P10的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.744，P=0.081），因此兩者的診斷價(jià)值相等。

表4 4種腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析和AUC比較

2.3.4 聯(lián)合模型最值臨界值 采用主成分分析法對(duì)PLC-BPD提取主成分，結(jié)果輸出為KMO=0.627、Bartlett球度檢驗(yàn)P＜0.001、方差累積貢獻(xiàn)率為76%。獲得主成分方程并計(jì)算結(jié)果，利用二元Logistic回歸進(jìn)行單因素分析，篩選出P＜0.1的變量。然后對(duì)滿足條件的主成分強(qiáng)制進(jìn)入二元Logistic回歸擬合，PLC-BPD統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示-2LL=195.882，Cox & Snell R2=0.482，Nagelkerke R2=0.643，H-L檢驗(yàn)=0.306，方程為Logistic（PLC）=-3.558+0.012×CEA+0.067×CA15-3+0.0 1 9×C Y F R A 2 1-1-0.0 0 3×C A 1 2 5+0.004×CA19-9+0.164×NSE-0.070×SCC-Ag。把Logistic（PLC）方程還原成原始變量方程并代入原始數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果，用Medcalc v11軟件繪制ROC交互點(diǎn)圖，最佳臨界值為-0.958 8，可疑值范圍為-1.276～-0.732，見圖2。將余下的38例PLC患者和50例BPD患者的腫瘤標(biāo)志物數(shù)據(jù)代入PLC-BPD模型，總符合率達(dá)82.9%，陽性符合率78.9%，陰性符合率86.0%。

3 討論

圖2 ROC交互點(diǎn)圖

肺癌患者的5年生存率主要取決于腫瘤分期，Ⅰ期患者的5年生存率達(dá)60%~70%，Ⅱ期為40%～50%，ⅢA期僅為15%～30%[2]，而患者在疾病的早期階段通常不會(huì)表現(xiàn)出特定的癥狀，因此PLC的早期確診對(duì)后續(xù)治療效果至關(guān)重要。目前，臨床主要采用腫瘤標(biāo)志物對(duì)可疑病例進(jìn)行篩查、評(píng)估預(yù)后，采用電子計(jì)算機(jī)斷層掃描或磁共振成像，結(jié)合組織檢查，輔以腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)診斷PLC。由于肺癌組織病理的多樣性和同種病理腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，對(duì)PLC的早期診斷僅靠單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物目前是無法實(shí)現(xiàn)的。多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不同類型PLC診斷的互補(bǔ)性可以有效彌補(bǔ)單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的不足，但腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合項(xiàng)目越多，檢測(cè)結(jié)果的假陽性率越高。合理、有效、經(jīng)濟(jì)的使用腫瘤標(biāo)志物組合既可對(duì)患者后續(xù)干預(yù)產(chǎn)生積極影響，也可避免不適宜檢測(cè)。在國內(nèi)現(xiàn)有的有關(guān)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)診斷PLC的文獻(xiàn)報(bào)道中，多數(shù)研究將重點(diǎn)放在腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的臨床價(jià)值上，但沒有說明如何獲取多種腫瘤標(biāo)志物組合。本研究通過探索性研究，建立了診斷PLC的預(yù)測(cè)模型，并以此作為PLC的腫瘤標(biāo)志物適宜檢驗(yàn)策略。

本研究建立的PLC預(yù)測(cè)模型既包含了PLC的特異性腫瘤標(biāo)志物（CYFRA 21-1、SCC-Ag、NSE、CEA），又納入了非特異性腫瘤標(biāo)志物（CA19-9、CA125、CA15-3）。CYFRA 21-1是目前對(duì)NSCLC（SQCL）最敏感的腫瘤標(biāo)志物，敏感性為23%～70%[12-13]，特異性約為90%[3]。NACB和EGTM均推薦CYFRA 21-1用于NSCLC的早期診斷和療效監(jiān)測(cè)[1-2]。ADC和LLC患者CEA水平顯著升高，與CYFRA 21-1結(jié)合可有效鑒別ADC和SQLC。有研究結(jié)果顯示，CEA不僅可用于PLC的診斷，還可作為化療效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[14]。SCC-Ag是SQLC的特異性腫瘤標(biāo)志物，有文獻(xiàn)報(bào)道SCC-Ag的敏感性僅為15%～55%，不適合作為診斷指標(biāo)[5]；但也有研究結(jié)果顯示，SCC-Ag結(jié)合CA125、NSE、CEA和CYFRA 21-1對(duì)NSCLC的診斷和分型有幫助[1，15]。SCLC患者的NSE陽性率顯著高于對(duì)照者，是SCLC高特異、高敏感的腫瘤標(biāo)志物[1-2]。這些PLC特異性腫瘤標(biāo)志物包含在公共因子2、3和4中，解釋了不同PLC亞型對(duì)PLC預(yù)測(cè)模型的貢獻(xiàn)率，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)這些PLC特異性腫瘤標(biāo)志物也彌補(bǔ)了單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)效能不足的缺陷。CA125、CA19-9和CA15-3分別是卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌的特異性指標(biāo)，不是PLC的優(yōu)勢(shì)型腫瘤標(biāo)志物。但CA125由于與肺腺癌細(xì)胞識(shí)別的免疫分子OC125相同，因此是卵巢癌和肺癌細(xì)胞共同具有的抗原；而CA15-3也被證實(shí)存在于肺腺癌內(nèi)[16]。有研究結(jié)果顯示，CA125、CA15-3與PLC的病理分型密切相關(guān)，SQLC以CA125陽性率升高為主，ADC以血清CA15-3水平升高為主[17-18]。另有研究結(jié)果顯示，檢測(cè)NSCLS患者CA15-3、CA199、CA125水平可用于監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況[19]。總之，對(duì)臨床高度懷疑為PLC的患者，CA125、CA199和CA15-3結(jié)合CYFRA 21-1、CEA檢測(cè)有一定的輔助診斷意義。因此，這些腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)在PLC預(yù)測(cè)模型中也有其合理性。有研究結(jié)果顯示，3種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)早期診斷PLC的最優(yōu)組合為CEA、CYFRA 21-1、NSE[20-24]，4種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的最優(yōu)組合為CEA、CYFRA 21-1、NSE、SCC-Ag[24-25]。采用Logistic回歸分析，使用PLC患者和BPD患者對(duì)這些腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)策略進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與其他聯(lián)合檢測(cè)策略比較，PLC預(yù)測(cè)模型的AUC和Youden指數(shù)均為最優(yōu)，在保持敏感性基本不變的前提下，提高了特異性，且真陽性檢出率大幅提高，見表5。進(jìn)一步說明了本研究建立的PLC預(yù)測(cè)模型的合理性。

綜上所述，本研究采用統(tǒng)計(jì)分析與臨床實(shí)踐結(jié)合的方法，對(duì)PLC的診斷指標(biāo)進(jìn)行了優(yōu)化和組合，從臨床常用于PLC診斷的12種腫瘤標(biāo)志物中遴選出7種腫瘤標(biāo)志物組成聯(lián)合檢測(cè)模型。結(jié)果顯示，PLC預(yù)測(cè)模型與單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)相比，平衡了敏感性和特異性，檢測(cè)項(xiàng)目的減少并未降低診斷效能，而且還減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，減少了不適宜檢驗(yàn)，具備一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，該模型是否能在臨床上推廣應(yīng)用仍有待驗(yàn)證。因?yàn)樵谥贫ㄅR床檢驗(yàn)策略時(shí)，還應(yīng)根據(jù)患者的實(shí)際病情推薦更細(xì)化的方案，如基于不同病種、不同病情提出更精準(zhǔn)、更有針對(duì)性的臨床適宜檢驗(yàn)方案，這也是我們下一步研究的方向。

表5 PLC預(yù)測(cè)模型與不同腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)策略比較