滇重樓種子檢驗(yàn)規(guī)程研究△

李瑪，蘇鈦，李云，陳明瑋，邱斌，段麗*

(1.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；2.云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

種子是最基本的生產(chǎn)資料，是育苗生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，開展中藥材種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量研究，制定種子檢驗(yàn)規(guī)程和種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能夠從源頭上保證中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定可控[1]，是國(guó)家推進(jìn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化的一項(xiàng)重要任務(wù)。與農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程相比，中藥材的種子質(zhì)量控制還非常落后，目前關(guān)于中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的工作已逐步展開，諸如三七[2]、射干[3]、青蒿[4]、遠(yuǎn)志[5]等藥材的種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法已見(jiàn)報(bào)道。

滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensisHand-Mazz.是百合科重樓屬多年生宿根性草本植物[6]，以干燥根及根莖入藥，藥材名重樓，它以重樓皂苷作為有效成分，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風(fēng)抽搐等癥[7]。隨著市場(chǎng)對(duì)滇重樓藥材需求的不斷增加，野生資源已不能滿足市場(chǎng)對(duì)滇重樓藥材的需求，人工馴化種植工作正在逐步開展。滇重樓的主要繁殖方式有切塊繁殖和種子繁殖，對(duì)比兩種繁殖方式，切塊繁殖大量消耗藥材，且繁殖率低，而種子繁殖率高，可大規(guī)模提供種苗，能夠滿足當(dāng)下滇重樓種植產(chǎn)業(yè)對(duì)種苗的需求。近年來(lái)對(duì)滇重樓的研究主要集中于化學(xué)成分的分析與測(cè)定、藥理作用、栽培繁育[8]方面，但對(duì)關(guān)乎種子質(zhì)量的種子檢驗(yàn)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)滇重樓種子的凈度、千粒重、真實(shí)性鑒定、含水量、生活力的檢測(cè)方法以及發(fā)芽條件進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期為制定滇重樓種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

滇重樓種子收集于云南省紅河州和文山州各滇重樓栽培區(qū)，經(jīng)中科院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為百合科重樓屬植物滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的種子。

2 方法

2.1 扦樣

2.1.1 種子批 根據(jù)滇重樓種子的市場(chǎng)流通情況和送驗(yàn)要求，確定滇重樓種子批的最大質(zhì)量和送驗(yàn)樣品的最小質(zhì)量。

2.1.2 扦取送驗(yàn)樣品和試驗(yàn)樣品 按GB/T 3543.2-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣》的規(guī)定執(zhí)行。樣品扦取后，干凈紙袋包裝，在室內(nèi)陰涼干燥處保存。

2.2 凈度分析

按GB/T 3543.3-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程凈度分析》的規(guī)定執(zhí)行。四分法從送驗(yàn)樣品中扦取試驗(yàn)樣品，并將其分成凈種子、其他植物種子和雜質(zhì)3種成分，測(cè)定各成分的重量百分比，重復(fù)4次。

2.3 種子真實(shí)性鑒定

采用種子形態(tài)鑒定法。隨機(jī)數(shù)取種子100粒，重復(fù)3次，逐粒對(duì)大小、形狀、顏色和表面構(gòu)造進(jìn)行觀察并記錄。

2.4 千粒重測(cè)定

按GB/T 3543.7-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程其他項(xiàng)目檢驗(yàn)》規(guī)定執(zhí)行。分別采用百粒法、五百粒法、和千粒法進(jìn)行測(cè)定。①百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取100粒，重復(fù)8次，分別稱重，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，變異系數(shù)(CV)<4.0%，測(cè)定值有效；②五百粒法：隨機(jī)從凈種子中數(shù)取500粒，重復(fù)4次，分別稱重，計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，變異系數(shù)(CV)<4.0%，測(cè)定值有效；③隨機(jī)從凈種子中數(shù)取1000粒，重復(fù)2次，分別稱重，計(jì)算平均值和重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比，重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比小于5.0%，測(cè)定值有效。

2.5 含水量測(cè)定

采用烘干減重法測(cè)定滇重樓種子含水量。按GB/T 3543.6-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程水分測(cè)定》規(guī)定執(zhí)行。將用于盛裝樣品的小鋁盒預(yù)先烘干1 h(130～133 ℃)并置于硅膠干燥器中冷卻備用。分別采用高恒溫法和低恒溫法對(duì)種子含水量進(jìn)行測(cè)定。①低恒溫法：分別在(103±2 ℃)低恒溫條件下，設(shè)置1、2、3、4、5、6、7、8、17 h計(jì)算種子水分損失量；②高恒溫法：分別在(131±2 ℃)高恒溫條件下，設(shè)置1、2、3、4、5、6、7、8、9 h計(jì)算種子水分損失量。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)(5±0.001)g。

2.6 生活力測(cè)定

采用紅四氮唑(TTC)法測(cè)定種子生活力。

2.6.1 種子預(yù)處理 室溫條件下，蒸餾水浸種12 h后，沿種臍縱切種子，取半粒備用。

2.6.2 染色條件的確定 取上述備好的種子進(jìn)行試驗(yàn)：分別設(shè)置TTC溶液濃度為0.01%、0.05%、0.1%，染色時(shí)間為1、2、3、4、5、6、7、8 h，于30、35、40 ℃條件下對(duì)種子進(jìn)行染色，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒種子。染色結(jié)束后，瀝去溶液，沖洗3～5次，觀察并計(jì)數(shù)。

2.6.3 滇重樓種子有無(wú)生活力標(biāo)準(zhǔn)建立 參照種子的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果，建立滇重樓種子TTC染色的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

2.7 發(fā)芽率測(cè)定

2.7.1 發(fā)芽前處理 自來(lái)水(ck)、無(wú)菌水、0.1%高錳酸鉀、1%次氯酸鈉各浸種10 min后，ck和無(wú)菌水浸種處理組直接置床，其余2處理組無(wú)菌水沖洗3次后置床，采用紙上法，置于20 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，觀察種子污染率，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)。

2.7.2 適宜發(fā)芽床的確定 發(fā)芽床設(shè)3個(gè)處理：(1)紙上：培養(yǎng)皿中鋪2層充分吸濕的濾紙，將預(yù)處理的種子均勻置床；(2)砂上：將拌好的含水量為20%的濕砂在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪10 mm厚，種子均勻置床，(3)蛭石：將拌好的含水量為20%的蛭石在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪10 mm厚，種子均勻置床，培養(yǎng)條件為20 ℃黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)，觀察統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽情況。

2.7.3 適宜發(fā)芽溫度的確定 發(fā)芽床為紙上，發(fā)芽溫度設(shè)定為恒溫15、20、25 ℃，黑暗下培養(yǎng)，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.4 光照對(duì)種子發(fā)芽的影響 以紙上為發(fā)芽床，于20 ℃恒溫條件下進(jìn)行光照(12 h光照，12 h黑暗)和24 h全黑暗處理，每個(gè)處理50粒種子，3次重復(fù)，觀察種子發(fā)芽情況。

2.7.5 發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間確定 根據(jù)種子發(fā)芽表現(xiàn)，確定初次計(jì)數(shù)時(shí)間和末次計(jì)數(shù)時(shí)間。以胚根伸出種皮2 mm時(shí)的天數(shù)為初次計(jì)數(shù)時(shí)間，以種子發(fā)芽數(shù)達(dá)到最高時(shí)，以后再無(wú)發(fā)芽種子出現(xiàn)時(shí)的天數(shù)為末次計(jì)數(shù)時(shí)間。

2.7.6 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果以發(fā)芽率表示：

(1)

3 結(jié)果與分析

3.1 扦樣

滇重樓種子批的最大質(zhì)量為2000 kg，凈度分析試樣是按至少含有2500粒種子推算而來(lái)，根據(jù)3.4結(jié)果，滇重樓種子千粒重為62.42 g，2500粒種子重量為187.26 g，所以確定滇重樓凈度分析試樣的最小重量為200 g，送驗(yàn)樣品為凈度分析的10倍以上，最少為2000 g。

3.2 凈度分析

試驗(yàn)中滇重樓種子均由所收集的果實(shí)洗去果皮并陰干表面水分所得，試樣均沒(méi)有其他植物種子，亦無(wú)雜質(zhì)，凈度為100%。

3.3 真實(shí)性鑒定

滇重樓果實(shí)蒴果室背開裂，棕黃色；種子多數(shù)，種皮肉質(zhì)多汁，櫻紅色，長(zhǎng)：6.64～7.42 mm，寬：5.09～5.52 mm，厚：5.47～6.10 mm；除去假種皮后種子呈卵球形，種子堅(jiān)硬，光滑，呈白色，長(zhǎng)：4.85～5.97 mm，寬：3.75～4.65 mm，厚：3.53～4.65 mm；種子一側(cè)有黃白色圓形種臍。

3.4 千粒重測(cè)定

隨機(jī)選取經(jīng)凈度分析后的滇重樓種子試樣進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。采用百粒法測(cè)定結(jié)果顯示變異系數(shù)(CV)大于4.0%，所以百粒法不適用于滇重樓種子千粒重的測(cè)定；根據(jù)結(jié)果顯示采用五百粒法及千粒法兩種方法測(cè)定時(shí)，測(cè)定值均有效，鑒于500粒法所用種子數(shù)量較少，因此，滇重樓種子適宜的千粒重測(cè)定方法為五百粒法。

表1 滇重樓種子千粒重測(cè)定

3.5 含水量測(cè)定

滇重樓種子含水量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。高恒溫烘干法中，1～6 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；6～7 h水分散失減慢，是緩慢失水的時(shí)期，7～9 h水分散失顯著減慢，是較慢的失水期，失去分解水，失水量趨于穩(wěn)定，烘干8 h與9 h之間無(wú)顯著差異；低恒溫烘干中，1～4 h滇重樓種子水分不斷失去，是快速失水期，失去自由水；之后水分散失減慢，是緩慢失水的時(shí)期；烘干17 h后種子含水量與高恒溫烘干8 h無(wú)顯著差異。因此，使用高恒溫烘干法烘干8 h測(cè)定滇重樓種子含水量。

表2 滇重樓種子水分測(cè)定

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P= 0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.6 生活力測(cè)定

3.6.1 染色條件的確定 滇重樓種子染色情況受染色的時(shí)間、溫度和染色液濃度的影響，生活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。綜合染色時(shí)間、濃度及染色效果，在30 ℃、0.01%TTC溶液染色效果最好；并且染色7 h與染色8 h無(wú)顯著差異。因此30 ℃、0.01%TTC溶液中染色7h宜作為滇重樓種子生活力檢測(cè)的染色條件。

3.6.2 有無(wú)生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)的確定 滇重樓種子脫落時(shí)，胚極不發(fā)育，而是一個(gè)很小、未完全分化的多細(xì)胞橢圓體，肉眼很難觀察到滇重樓種子的胚，根據(jù)TTC染色法的原理，結(jié)合滇重樓種子的實(shí)際情況，有活力的滇重樓種子整個(gè)縱切面被TTC染為鮮紅色，染色均勻。滇重樓種子有無(wú)生活力鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下，有活力的滇重樓種子：胚乳被TTC溶液染為鮮紅色或淺紅色，種子切面全部著色或大部分著色，染色均勻；無(wú)生活力的滇重樓種子：胚乳完全不著色或著淺色，染色不均勻；或局部著色，著色較淺。

表3 滇重樓種子生活力測(cè)定

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.7 發(fā)芽率測(cè)定

3.7.1 滇重樓種子發(fā)芽前處理 由表4可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)殺菌劑處理的滇重樓種子在試驗(yàn)結(jié)束后種子的發(fā)芽率明顯高于ck，結(jié)果表明，在試驗(yàn)前使用殺菌劑處理種子，能夠抑制霉菌污染，保證在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)有足夠的種子用于統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，提高計(jì)數(shù)的便利性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，滇重樓種子發(fā)芽前出理方法為0.1%高錳酸鉀溶液浸泡10 min。

3.7.2 適宜發(fā)芽床的確定 由表5可見(jiàn)，紙上、沙上、和蛭石3種發(fā)芽床處理對(duì)滇重樓種子發(fā)芽無(wú)顯著的影響，均可作為滇重樓種子的發(fā)芽床，但考慮試驗(yàn)操作的簡(jiǎn)單性和觀察統(tǒng)計(jì)的便宜性，選取紙上作為滇重樓種子的最適發(fā)芽床。

表4 發(fā)芽前不同處理對(duì)滇重樓種子發(fā)芽率的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 不同發(fā)芽床對(duì)種子發(fā)芽率的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.7.3 適宜發(fā)芽溫度的確定 在紙上黑暗培養(yǎng)條件下，20 ℃條件下種子發(fā)芽與15 ℃和25 ℃條件下種子發(fā)芽存在顯著差異。因此滇重樓種子適宜的發(fā)芽溫度為20 ℃。

表6 溫度對(duì)滇重樓種子發(fā)芽的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.7.4 光照條件的確定 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7，種子在光照條件下和黑暗條件下發(fā)芽率存在顯著差異，所以滇重樓種子發(fā)芽時(shí)選擇全黑條件對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。

表7 光照對(duì)滇重樓種子發(fā)芽的影響

注：處理間多重比較采用LSD法，差異顯著性分析取P=0.05水平，同一列中含有不同字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.7.5 發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間的確定 種子置發(fā)芽床后第30 d胚根突破種皮約2 mm，以后種子逐漸發(fā)芽，第80 d后發(fā)芽速率明顯下降，100 d后，發(fā)芽基本結(jié)束，見(jiàn)圖1。

圖1 滇重樓種子發(fā)芽率與發(fā)芽時(shí)間的關(guān)系

因此，整個(gè)發(fā)芽計(jì)數(shù)時(shí)間在第30～100 d。因此滇重樓種子初次計(jì)數(shù)時(shí)間為30 d，末次計(jì)數(shù)時(shí)間為100 d。

4 結(jié)論與討論

市場(chǎng)滇重樓種子交易物為果實(shí)，需去除果皮及假種皮后方可播種，本研究中滇重樓種子是收集果實(shí)去除果皮后所得，凈度為100%，因此，質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程中未考慮凈度分析。

目前，滇重樓種植面積在不斷擴(kuò)大，各種植區(qū)間相互引種以及同屬植物種子摻入，是引起滇重樓種子混雜的原因，僅僅通過(guò)外觀形態(tài)觀測(cè)很難對(duì)種子真實(shí)性進(jìn)行有效的鑒定，如果做田間鑒定則要到成苗期才能判斷，所需時(shí)間較長(zhǎng)，筆者有意借助分子生物學(xué)手段對(duì)滇重樓種子進(jìn)行鑒定，但具體方法有待進(jìn)一步研究。

在進(jìn)行滇重樓種子生活力檢測(cè)時(shí)，筆者分別運(yùn)用TTC法和紅墨水法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)有活力的種子和通過(guò)沸水殺死的死種子均能被紅墨水染色，采用紅墨水法不能有效測(cè)定滇重樓種子生活力。因此TTC染色法是測(cè)定滇重樓種子生活力的有效方法。滇重樓種子成熟脫離植株時(shí)，胚極不發(fā)育，肉眼不可見(jiàn)，在制定滇重樓種子生活力測(cè)定的染色標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要參照種子發(fā)芽率的測(cè)定結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果顯示，以此方法測(cè)定的種子生活力越高，其對(duì)應(yīng)種子的發(fā)芽率也越高，之后筆者對(duì)30個(gè)批次的滇重樓種子進(jìn)行了生活力和發(fā)芽率的測(cè)定，其結(jié)果符合上述規(guī)律，證明TTC法測(cè)定滇重樓種子生活力方法可靠，鑒定標(biāo)準(zhǔn)成立，結(jié)果可信。

先前有學(xué)者報(bào)道，滇重樓種子具有形態(tài)-生理休眠特性，萌發(fā)速率慢，萌發(fā)率低等原因限制了滇重樓的人工栽培[9]，在本試驗(yàn)中，筆者采用的實(shí)驗(yàn)材料為剛從植株上取下去除假種皮后的新鮮種子，之后立即對(duì)種子進(jìn)行處理，處理?xiàng)l件為20 ℃恒溫暗培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理30 d后種子開始發(fā)芽，100 d后發(fā)芽率可達(dá)97%以上。這表明，種子采收后立即給予合適的處理?xiàng)l件可以加快滇重樓種子胚形態(tài)的發(fā)育進(jìn)程，縮短發(fā)芽時(shí)間，提高種子發(fā)芽率。滇重樓種子發(fā)芽進(jìn)程緩慢，即使在適宜的條件下發(fā)芽周期亦長(zhǎng)達(dá)100 d，在整個(gè)發(fā)芽進(jìn)程中，要及時(shí)觀察發(fā)芽床的濕度，應(yīng)保持發(fā)芽床始終保持濕潤(rùn)。同時(shí)，培養(yǎng)箱內(nèi)不能擺放過(guò)多的樣品，以免影響通風(fēng)，使向內(nèi)各處溫度不均衡從而影響種子發(fā)芽進(jìn)程。

滇重樓生長(zhǎng)緩慢，從種子到藥材一般需要5～8年的時(shí)間，對(duì)于后期滇重樓藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究及劃分，以及不同等級(jí)的滇重樓種子對(duì)應(yīng)的藥材質(zhì)量等研究，需要后期更長(zhǎng)時(shí)間的努力。

本研究從扦樣、凈度分析、真實(shí)性鑒定、含水量、千粒重等方面對(duì)滇重樓種子檢驗(yàn)方法進(jìn)行了研究，制定了適宜滇重樓種子的檢驗(yàn)規(guī)程，見(jiàn)表8。

表8 滇重樓種子檢驗(yàn)規(guī)程

筆者利用本研究建立的滇重樓種子檢驗(yàn)規(guī)程，先后對(duì)30份滇重樓種子樣品進(jìn)行檢測(cè)，盡管表明不同產(chǎn)地的種子，在發(fā)芽率、生活力等指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果有差異，但是方法穩(wěn)定，廣泛適用于滇重樓種子質(zhì)量的控制。所以此規(guī)程適用于滇重樓種子質(zhì)量檢驗(yàn)，能夠?yàn)橹兴幉牡嶂貥欠N子的規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。