基于化學模式識別技術的不同產地土炒白術質量比較研究△

王小平，楊麗珠，夏玉蘋，陳育青，王瓊珺，謝偉容

(1.漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000；2.江西中醫藥高等專科學校，江西 撫州 344000)

白術為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的根莖，具健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎之功能[1]。白術最早載于《神農本草經》，作為土炒炮制法代表藥物之一，土炒白術在歷代醫書中多有記載，如《本草蒙筌》“陳壁土制，竊真氣驟補中焦”[2-3]。清代名醫傅山在《傅青主女科·女科卷》收錄80首方中，使用白術的方劑有48首，其中白術土炒就占有45首[4]。據現代研究，土炒輔料可協同增強白術的健脾止瀉作用，并實驗證明土炒白術組方的參苓白術散對降低脾虛小鼠的腹瀉指數及提高脾虛小鼠的脾虛指數的作用強于麩炒白術[5-6]。但由于炮制輔料土來源復雜，各地土炒工藝及評價標準不統一，土炒白術飲片質量良莠不齊，影響臨床安全有效用藥。因此，為考察市場上土炒白術飲片質量情況，本實驗收集了全國不同產地的10批白術土炒品，研究比較其中所含化學成分差異，為其質量評價及臨床安全用藥提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國)；METTLER-TOLEDO AB265-S型電子分析天平(瑞士)；FST-Ⅲ-10 精密型超純水機(上海富詩特)；OHAUS AR2140電子分析天平(上海)；KQ5200超聲波清洗器(昆山)。

1.2 材料

土炒白術炮制品，購自福建、江西、安徽、四川等全國不同地區，經本院中藥教研室陳育青副教授鑒定為菊科植物白術AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖的土炒加工品，樣品詳細信息見表1；白術內酯Ⅰ(批號：MUST-17030201)、白術內酯Ⅱ(批號：MUST-17030202)、白術內酯Ⅲ(批號：MUST-17030203)，購自成都曼斯特生物科技有限公司，含量≥99%；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004A，國家藥典委員會)；試劑除HPLC用乙腈為色譜純外，其他均為分析純。

表1 不同產地土炒白術樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min：45% A→70% A；20～40 min：70% A→85% A；40～50 min：85% A→55%A)；50～60 min：55% A→45% A)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：242 nm；柱溫：30 ℃。

2.2 試液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅲ各適量，加甲醇制成每1 mL分別含65.10、83.20、60.15 μg的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取土炒白術樣品適量，粉碎過60目，精密稱取2 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，密塞，精密稱重，超聲提取(功率200 W，頻率40 kHz)45 min，取出，再稱重，補足減失重量，取上清液，臨用前用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 測定法

分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄60 min色譜圖，結果見圖1。

注：a.白術內酯Ⅲ；b.白術內酯Ⅱ；c.白術內酯Ⅰ；R.參照物；S.白術土炒品。圖1 白術土炒品HPLC指紋圖譜

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液(土炒白術樣品S1)注入高效液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件，連續進樣6次，記錄色譜圖，將圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，結果各樣品相似度均大于0.99，RSD為0.28%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.06%～0.25%和0.37%～0.62%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取土炒白術樣品S1共6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖，將圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，結果各樣品相似度均大于0.98，RSD為0.60%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.08%～0.49%和0.59%～1.81%之間，表明該分析方法重現性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液(土炒白術樣品S1)，按照2.1項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、24 h進樣，記錄色譜圖并積分，將圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統處理，結果各樣品相似度均大于0.98，RSD為0.74%。各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積值的RSD值分別在0.07%～0.60%和0.51%～1.16%之間，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 土炒白術HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 土炒白術HPLC指紋圖譜采集 分別取10批不同土炒白術樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進行測定，記錄10批樣品HPLC 色譜圖，將其導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，得土炒白術累加圖譜，見圖2。

2.5.2 指紋圖譜共有峰的標定 以中位數法生成對照指紋圖譜，設定時間窗寬度為0.30 min，軟件自動匹配圖譜，將10批次土炒白術樣品圖譜都匹配的色譜峰標定為共有指紋圖譜峰。結果本研究共標定有13個共有指紋峰，同時建立對照指紋圖譜，見圖3。根據參照物色譜峰，可知7號為白術內酯Ⅱ峰，其在指紋圖譜中保留時間及峰面積適當，故選用其(S號峰)作為參照峰，見圖3。

2.5.3 相似度評價 以參照峰的保留時間和峰面積作為1，分別計算不同土炒白術樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表2、表3。依指紋圖譜相似度軟件計算10批不同土炒白術樣品HPLC 指紋圖譜相似度，見表4。

注：S1～S10.10批不同土炒白術；R.對照圖譜。圖2 土炒白術樣品疊加譜及對照指紋譜

注：峰3.白術內酯Ⅲ；峰7.白術內酯Ⅱ；峰10.白術內酯Ⅰ。圖3 10批土炒白術樣品HPLC指紋圖譜共有峰

表2 不同產地白術土炒品共有峰相對保留時間

表3 不同產地白術土炒品共有峰相對峰面積

表4 不同產地白術土炒品HPLC指紋圖譜相似度計算結果

注：S對*為對照指紋圖譜。

由表4可知，不同產地白術土炒品之間的指紋圖譜相似度值存在差異性。與對照指紋圖譜相比較，江西樟樹(S2)、河北安國(S3)、福建漳州(S4)、福建漳州(S5)、浙江磐安(S8)、四川樂山(S9)、安徽亳州(S10)等土炒品相似度值均在0.85以上，而廣東普寧(S1)、福建漳州(S6)、江蘇蘇州(S7)等相似度值均在0.6以下。

2.6 系統聚類分析(HCA)

將各色譜峰面積相對于稱樣量量化，利用SPSS 19.0分析軟件對樣品進行系統聚類分析，采用組間平均數聯接法，以平方歐氏距離作為樣品相似度的距離公式。結果10個樣品基本可分為3大類(見圖4)，S3、S4、S5、S8、S9聚為第1類，S1、S6、S7聚為第2類，S2、S10聚為第3類。

圖4 不同產地白術土炒炮制品聚類譜系圖

2.7 樣品主成分分析(PCA)

分別將10批樣品各色譜峰峰面積輸入Excel 表格內，得到批數×色譜峰數的數據矩陣，導入SIMCA-P 14.1軟件中進行PCA分析(見圖5)。結果發現10 批樣品基本可分為3 組，樣品S1、S6、S7 為1類，S2、S10 為1類，S3、S4、S5、S8、S9為1類，與系統聚類分析結果一致。

圖5 不同產地白術土炒炮制品主成分分析得分散點圖

2.8 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)

為確定各樣品組間差異性，采用PLS-DA模式識別方法，篩選出組間成分差異貢獻率較大的共有峰。分別將10批樣品共有峰峰面積輸入Excel 表格內，得到批數×共有色譜峰數(10×13)的數據矩陣，導入SIMCA-P 14.1軟件中進行PLS-DA模型擬合，并分析生成差異性標記物的變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)圖(見圖6)，其中VIP>1的成分有5個，影響大小依次為峰5、峰7(白術內酯Ⅱ)、峰10(白術內酯Ⅰ)、峰3(白術內酯Ⅲ)、峰11，表明這些成分是不同產地白術土炒品之間成分差異的主要標記物，對其質量差異的影響較大。

圖6 不同產地白術土炒品差異性變量VIP圖

3 討論

本實驗對不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇)、不同提取時間(30 、45、60 min)和超聲(功率200 W，頻率40 kHz)、回流兩種提取方法進行比較，結果表明甲醇超聲45 min 提取的供試品溶液色譜峰數多，組分含量高。

由實驗結果分析，不同產地土炒白術樣品內含化學成分的存有差異，而其藥效成分白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ等又是成分差異主要標記物，影響其臨床組方藥效。因此，為提高中藥飲片的安全性、有效性，應增加土炒白術中白術內酯Ⅱ、白術內酯Ⅰ、白術內酯Ⅲ等內酯類成分的含量控制。

土是固體炮制輔料中最特殊的一類，其不僅作為傳熱體，而且通過在中藥飲片表面“掛土色”而與飲片一起入藥，是最能體現傳統“藥輔合一”的制藥理念。《黃帝內經》：“土者脾也，生萬物而法天地。”《本草綱目》：“土者，五行之主，……，在人則脾胃應之，故諸土入藥，皆取其裨助戊已之功。”《景岳全書》“炒以壁土，欲助其固。”目前，輔料土可選用伏龍肝、壁土、黃土、紅土、白土、紅磚粉、赤石脂等[4,7-8]，性質效用不一，是導致土炒白術質量差異大的主要原因。根據土炒炮制目的，伏龍肝是最符合傳統炮制意圖的輔料。因此，加強土炒炮制輔料研究，是傳承中藥特色土炒炮制方法亟待解決的課題。