HPLC同時測定黑老虎中3個木脂素類化合物的含量

楊能英，何風雷，彭富全，陳明權(quán)，農(nóng)根林

(廣州白云山陳李濟藥廠有限公司，廣東 廣州 510288)

黑老虎為五味子科南五味子屬植物冷飯團Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根，別名過山龍、大鉆、臭飯團、鉆地風等，主要分布于我國江西、湖南、福建、廣西、四川、云南等地。味辛、微苦，性溫，具有行氣活血、祛風止痛的功能，主要用于治療風濕痹痛、痛經(jīng)、脘腹疼痛、跌打損傷等[1-2]。在民間黑老虎常用于治療胃、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、急性胃腸炎、風濕性關(guān)節(jié)炎、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛等癥[3]。黑老虎的主要生理活性成分為木脂素和三萜酸[4]。其中木脂素結(jié)構(gòu)類型較多，立體化學復雜，而且具有抗肝炎、抗艾滋病毒和抗腫瘤等活性[5-6]。黑老虎藥材標準收載于《廣東省中藥材標準》2004年版(第一冊)，標準中沒有含量測定項。本實驗對黑老虎中3個木脂素類化合物的含量測定方法進行了研究，為黑老虎藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀，Sartorious(CP225D)十萬分之一天平，Sartorious(BS110S)萬分之一天平。SB-5200DT超聲波清洗機(300 W，40 Hz)。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥

日本南五味子素甲(純度為98.2%)、乙酰日本南五味子素甲(純度為97.5%)和(2′S)-南五味子木脂素J(純度為98.7%)對照品，均為自制，由中國科學院華南植物園魏孝義研究員進行結(jié)構(gòu)解析，鑒定[7-9]。

黑老虎藥材防城港1、防城港2、防城港3采挖于廣西防城港，還有采挖于福建武平、廣東梅州等地的樣品各1批，其余7批黑老虎藥材購于廣西玉林中藥材市場，產(chǎn)地越南，批號分別為1607002、1610001、1704001、1705001、1610002、1703001、1703002，編號為越南1、越南2、越南3、越南4、越南5、越南6、越南7，由廣東藥科大學李鐘副教授鑒定為五味子科南五味子屬植物冷飯團Kadsuracoccinea(Lem.)A.C.Smith的干燥根。

乙腈、甲醇為色譜純；水為Millipore去離子水；磷酸、乙醇等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈為流動相A，甲醇為流動相B，0.1%磷酸-水為流動相C，梯度洗脫(0→5 min，35%→40%A，5%→10%B，60%→50%C；5→30 min，40%→45%A，10%→15%B，50%→40%C；30→65 min，45%→80%A，15%→5%B，40%→15%C)；檢測波長為214 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為30 ℃。HPLC圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取各對照品適量，分別置于3個50 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。各成分對照品溶液的質(zhì)量濃度分別為日本南五味子素甲0.177 8 mg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲0.164 6 mg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 0.191 8 mg·mL-1。分別量取10、10、20 mL，置于同一50 mL量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品(日本南五味子素甲35.56 μg·mL-1、乙酰日本南五味子素甲32.92 μg·mL-1、(2′S)-南五味子木脂素J 76.72 μg·mL-1)。

注：A.混合對照品；B供試品；1.日本南五味子素甲；2.乙酰日本南五味子素甲；3.(2′S)-南五味子木脂素J。圖1 黑老虎藥材及對照品HPLC圖

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取黑老虎藥材細粉(過四號篩)0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對照品1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，分別用乙醇稀釋至刻度，每個質(zhì)量濃度取10 μL注入高效液相色譜儀，依法測定，以對照品的進樣量X(ng)為橫坐標，以峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，得線性回歸方程，結(jié)果見表1，可以看出各成分在各自進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 3個木脂素成分的線性關(guān)系考察

2.5 精密度試驗

取同一批號黑老虎藥材(批號：1610002)，按2.3項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6針，依法測定，結(jié)果日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的峰面積RSD分別為1.02%、0.86%、1.35%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批號黑老虎藥材(批號：1610002)，6份，每份約0.5 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，測得日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量RSD分別為1.85%、2.23%、1.52%(n=6)，結(jié)果表明該方法具有良好的重復性。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批號黑老虎藥材(批號：1610002)，按2.3項下制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、24 h依次進樣，依法測定，日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的平均峰面積分別為892.6、513.2、1475.7，RSD分別為0.98%、1.94%、2.05%(n=6)。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取同一批號黑老虎藥材(批號：1610002)6份，每份約0.25 g，精密稱定，每份中分別加入對照品溶液：日本南五味子素甲(0.177 8 mg·mL-1)2 mL、乙酰日本南五味子素甲(0.164 6 mg·mL-1)1.5 mL、(2′S)-南五味子木脂素J(0.191 8 mg·mL-1)4 mL，按2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.9 黑老虎藥材含量測定

2.9.1 黑老虎藥材含量測定 取黑老虎藥材10批，分別為廣西防城港采挖的3個樣品(防城港1，防城港2，防城港3)和產(chǎn)于越南的7批樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算供試品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量，結(jié)果見表3。

表2 黑老虎中3個木脂素類成分回收率試驗結(jié)果

表3 10批黑老虎藥材中3個木脂素成分含量測定 %

2.9.2 黑老虎藥材皮部、木部含量測定 取廣西防城港3個樣品和越南進口4批樣品，將皮部和木部分離，粉碎，取細粉(過四號篩)按2.3項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算供試品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、(2′S)-南五味子木脂素J的含量，結(jié)果見表4。

3 討論

本實驗采用甲醇、乙醇、70%甲醇水、70%乙醇水、稀乙醇作為提取溶劑，采用超聲提取，提取效果沒有顯著差異，因此，選用無毒的乙醇作為提取溶劑。考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-乙腈-0.1%磷酸水等流動相的等度和梯度洗脫，通過比較3個成分的峰形、分離度及保留時間，綜合考慮，最終選擇了文中甲醇-乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)，采用梯度洗脫，可以得到比較理想的色譜峰。

從10批藥材含量測定結(jié)果可以看出，日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的質(zhì)量分數(shù)分別在0.021 9%～0.159 5%、0.031 8%～0.176 7%和0.036 4%～0.702 8%，3個成分中(2′S)-南五味子木脂素J含量相對較高。對于黑老虎藥材的指標成分含量測定還需要收集更多的樣品，確定指標成分的含量限度。

黑老虎藥材的木部和皮部很容易分離，對同一樣品的皮部和木部分離后，分別取其細粉，進行3個木脂素的含量測定，發(fā)現(xiàn)皮部和木部均含有這3個成分，但在皮部和木部中的含量并不一樣，差異較大。7批樣品中，日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大為1∶5.8，乙酰日本南五味子素甲在皮部和木部的含量比最大為1∶3.4；(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量比最大為1∶34.3，且在木部中含量較高，可以看出(2′S)-南五味子木脂素J在皮部和木部的含量差異最大。皮部和木部的含量差異可能與采挖季節(jié)和生長年限有關(guān)。

(2′S)-南五味子木脂素J在體外藥效實驗證明，對肝癌細胞增殖具有較好的抑制作用[10]，該成分在黑老虎藥材中含量相對較高，特別是在木部中含量更高，提示提取該活性成分可以考慮從木部提取或者采用木部入藥。

通過對福建武平、廣東梅州、廣西防城港、越南等地的黑老虎樣品進行檢測，比較不同產(chǎn)地黑老虎樣品中日本南五味子素甲、乙酰日本南五味子素甲、和(2′S)-南五味子木脂素J的的含量，發(fā)現(xiàn)福建武平、廣東梅州含量很低，廣西防城港的樣品含量相對較高，而越南進口的黑老虎樣品含量更高，說明黑老虎藥材中所含成分地域差異性較大。

表4 黑老虎藥材皮部和木部含量測定