金蓮花不同花部提取物的抗炎活性△

李德利，方明月，王青青，劉雙月，賡迪，王如峰*，馬超

(1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.北京林業大學 生物科學與技術學院，北京 100083)

金蓮花又名旱金蓮、旱荷、金梅草、金疙瘩等，是毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花，具有清熱解毒、消腫明目的功效[1-2]。近年臨床研究報告顯示，金蓮花在治療急性咽炎、風熱感冒等方面療效顯著，已有多種劑型運用于臨床，有報道稱金蓮花抗炎的作用甚至高于臨床常用的抗炎藥[3-4]。金蓮花化學成分明確，主要化學成分有黃酮類、酚酸類和生物堿類。其中，黃酮類的含量最高，總黃酮約占金蓮花干重的16%[5-6]，被認為是金蓮花中最主要的活性物質。

本課題組在前期研究中發現，金蓮花的不同花部，即花萼、花冠、花蕊群(雄蕊和雌蕊)、子房、花柄中的總黃酮含量存在差異[7]；但是還不清楚它們的抗炎活性是否也有所不同，各花部的抗炎活性與其總黃酮含量是否存在相關性。為此，本文采用細菌脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞模型研究了金蓮花各花部提取物對一氧化氮(NO)分子釋放量的影響，并結合各花部提取物的總黃酮含量測定，對各花部提取物的抗炎活性與其總黃酮含量的相關性進行了探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-300VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，METTLER AE240型1/10萬電子天平，旋轉蒸發儀(上海亞榮生物儀器廠)，MC-18AIC(UV)CO2培養箱(Sanyo公司)，SW-CJ-10潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，ECLIPSETE2000-S倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)，Epoch全自動酶標儀(Bio Tek公司)，30～300 μL八道移液器(Eppendorf公司)，1000 μL/200 μL/20 μL單道移液器(Thermo公司)。

1.2 藥品與試劑

金蓮花購自河北安國藥材市場，經北京中醫藥大學王如峰教授鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。葒草素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：YD0001502-171110)；96孔細胞培養板(Corning公司)；DMEM 培養基(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司)；小鼠巨噬細胞系RAW264.7(中國醫學科學院基礎醫學院細胞中心)；實驗試劑乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磺胺、1-萘胺均為分析純。

2 方法

2.1 花部提取物的制備

將金蓮花按各花部(花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄)分離，取材如圖1所示。稱取各花部10 g，95%乙醇超聲提取2次，第一次30倍量乙醇提取30 min，第二次40倍量乙醇提取30 min，合并兩次提取液，四層紗布過濾，常溫下減壓濃縮，揮干至恒重，即得金蓮花各花部提取物，各花部提取率為提取物質量/花部質量[8]。

圖1 金蓮花花部模式圖

2.2 花部提取物總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取葒草素對照品20.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加適量95%乙醇，50 ℃水浴加熱溶解，放冷，用95%乙醇稀釋至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中，用95%乙醇稀釋至刻度，即得對照品溶液。其中葒草素的質量濃度為200 mg·L-1。

2.2.2 標準曲線制備 精密量取對照品溶液0、1、3、5、7、9、11 mL，分別置于25 mL量瓶中，加95%乙醇至11 mL，搖勻；然后，分別加入5% NaNO2溶液1 mL，搖勻；放置6 min后，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻；再放置6 min后，加入4% NaOH 溶液10 mL；最后，用95%乙醇稀釋至體積，搖勻。放置15 min后，以第一管作為空白對照，用比色法在510 nm處測定吸光度，以質量濃度為橫坐標(X)、吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，求出回歸方程[8]。

2.2.3 總黃酮含量測定 稱取各花部醇提取物20 mg，于1 mL 95%乙醇中完全溶解，經0.22 μm濾膜過濾后，量取0.5 mL于25 mL容量瓶中。同標準曲線制作方法，測定510 nm處吸光度(A)值，由線性回歸方程計算各花部提取物總黃酮質量濃度。依公式(1)計算各花部提取物總黃酮含量(W)。各花部生藥總黃酮含量為提取物總黃酮含量×提取率。

(1)

式中：C為質量濃度，V為測定體積，N為稀釋倍數，M為總提取物質量，m為測定質量。

2.3 抗炎活性實驗

2.3.1 最大無毒濃度 取對數生長期的RAW264.7細胞，制成密度為1.5×105個·mL-1的細胞懸液，接種于96孔板中培養，每孔100 μL。培養12 h待細胞貼壁后，棄去舊的培養液，依次加100 μL含藥培養液(80、160、320、640 μg·mL-1各花部提取物和25、50、100、200、400 μmol·L-1阿司匹林)，空白對照組加等量含有PBS的培養液，每組設4個平行孔。藥物作用于細胞20 h后，棄去含藥培養液，每孔加入質量濃度為0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL，混勻。繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結晶充分溶解。用酶標儀測定每孔的吸光度(A)值，檢測波長為490 nm。根據測得的A值計算細胞存活率。

2.3.2 抗炎實驗 通過構建LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，Griess試劑法測定細胞培養液中NO釋放量，能直觀反映炎癥的發生，因此以評價NO分子的分泌量來篩選抗炎藥物是一種普遍運用且簡單可行的方法[9-10]。取對數生長期的RAW264.7細胞，制成密度為1.5×105個·mL-1的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，培養12 h，待細胞貼壁后棄去舊培養液。加入新鮮的含藥和LPS的培養基120 μL，其中LPS質量濃度為1 μg·mL-1。設空白對照組、陰性對照組、陽性對照組(阿司匹林 25、50、100、200、400 μmol·L-1)和不同劑量加藥組(16、32、64 μg·mL-1各花部提取物)，培養20 h后吸取上清液，加入Griess試劑A液(1%磺胺)，混合均勻后37 ℃孵育10 min，再加入Griess 試劑B液(0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽)，混合均勻后37 ℃孵育10 min。在自動酶標儀上測定540 nm下的吸光度值。根據標準曲線Y=0.001 8X+0.049 9(r=0.999 8)求出各組的NO濃度，按公式(2)計算NO抑制率。

(2)

式中：CLPS組為LPS組NO質量濃度，C實驗組為實驗組NO質量濃度。

2.4 數據統計分析

3 結果

3.1 花部提取物總黃酮含量

以已知濃度的葒草素為對照，制作標準曲線，得回歸方程Y=0.003 6X+0.044 3(r=0.999 7)，表示對照品在8～88 μg·mL-1線性關系良好。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄中均含黃酮類成分，但各花部提取物之間的總黃酮含量存在統計學差異(P<0.01)。各花部提取物中總黃酮含量順序為：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群；結合各花部的提取率，計算各花部生藥的總黃酮含量順序為花萼>花柄>花冠>子房>花蕊群。具體含量見表1。

表1 金蓮花各花部及提取物中總黃酮含量

注：各花部提取物及花部之間比較，**P<0.01。

3.2 花部抗炎活性

3.2.1 最大無毒濃度 采用MTT法測定了不同質量濃度的金蓮花5個花部提取物及陽性藥阿司匹林對RAW264.7細胞存活率的影響，結果如圖2所示。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、花柄4個花部提取物質量濃度在80～640 μg·mL-1時，子房提取物質量濃度在80～320 μg·mL-1時細胞存活率與陰性對照組無統計學差異，表明在此質量濃度下，各花部提取物對RAW264.7細胞的正常生長無毒性影響。陽性對照組阿司匹林在實驗濃度(25、50、100、200、400 μmol·L-1)下對RAW264.7細胞無細胞毒作用。

注：**P<0.01表示該提取物質量濃度下具有細胞毒性。圖2 各花部提取物對RAW264.7細胞存活率的影響

3.2.2 抗炎活性結果 LPS組與空白對照組相比，NO釋放量明顯增加，差異具有統計學意義(P<0.01)；陽性藥阿司匹林對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量具有明顯的抑制作用，其NO釋放量比LPS組明顯減少，且各濃度均具有統計學差異(P<0.01)，如圖3所示，表示LPS能誘導炎癥的發生，該細胞炎癥模型構建成功。

注：與LPS組相比，**P<0.01。圖3 阿司匹林對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的影響

利用上述構建的細胞模型，用Griess試劑法測定了金蓮花5個花部提取物在16～64 μg·mL-1對LPS誘導的RAW264.7細胞NO分子的釋放量。與LPS組相比，花蕊群和子房兩個部位在實驗濃度下對NO釋放量有顯著性抑制作用(P<0.01)，花萼和花柄濃度在32～64 μg·mL-1時，抑制作用明顯(P<0.01)，花萼在16 μg·mL-1時抑制作用較弱(P<0.05)，而花冠只在最高濃度即64 μg·mL-1時表現出抑制作用(P<0.05)，如圖4所示。由抑制率公式計算NO抑制率，結果如表2所示，相同質量濃度下花蕊群和子房提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的抑制率比其他花部高，且二者的抑制率之間無差異。其次是花萼和花柄提取物，二者對NO釋放抑制作用的效果相當，均高于花冠提取物。

注：與LPS組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各花部提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放量的影響

表2 各花部提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞NO釋放的抑制率

注：和花蕊群比較，#P<0.05，##P<0.01；和子房比較，△P<0.05，△△P<0.01；和花萼比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3.3 各花部提取物抗炎活性與其總黃酮含量的相關性

金蓮花各花部的提取物具有良好的抗炎活性，為直觀反映提取物抗炎活性與其總黃酮含量之間的關系，根據3.1項下結果，計算實驗條件下(16、32、64 μg·mL-1，加藥體積100 μL)各花部提取物中的總黃酮含量，其與NO分子釋放抑制率對應關系如圖5所示。在本實驗濃度范圍內，各花部提取物對NO分子釋放的抑制率與各自總黃酮含量之間存在劑量依賴性；即同一花部，提取物總黃酮含量越高，對NO分子釋放的抑制作用越強；但從不同花部之間比較來看，各花部提取物對NO分子的抑制率與總黃酮含量之間無明顯關系(Spearman相關系數r=-0.035 71，P>0.05)。如子房和花蕊群兩個花部提取物中的總黃酮含量較其他花部少，抑制率卻最高；花萼和花柄部位提取物的總黃酮含量最高，但對NO分子釋放的抑制效果并不是最好。

圖5 花部提取物總黃酮含量與NO釋放抑制率的關系

4 討論

金蓮花各花部提取物及花部之間的總黃酮含量存在顯著差異，即花部之間：花萼>花柄>子房>花蕊群>花冠，與文獻報道一致[7]；提取物中：花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群。為進一步明確各花部提取物中總黃酮含量和抗炎活性之間的關系，借助LPS誘導的RAW264.7細胞模型，研究了相同質量濃度下不同花部提取物對細胞NO分子釋放量的影響。NO分子在炎癥的發生發展過程中扮演著重要角色，參與致炎因子的分布和損傷等病理過程。通常炎癥發生時，NO分子的釋放量明顯增加[11-12]。本文通過計算各花部提取物對NO分子的抑制率來表征各花部提取物的抗炎作用，結果表明金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄提取物均能抑制NO分子的產生，表現出一定程度的抗炎作用，且子房和花蕊群>花萼和花柄>花冠提取物。結合各花部提取物中的總黃酮含量測定結果，表明金蓮花不同花部抗炎活性的強弱與各花部提取物中總黃酮的含量不成正比，提示黃酮類成分并不是金蓮花抗炎活性的唯一藥效物質。本課題組前期關于金蓮花各花部的指紋圖譜研究[13]也表明，雖然子房和花蕊群與其他花部的指紋圖譜相似，但是其主要黃酮類成分的含量卻低于其他花部。因此，除了黃酮類之外，金蓮花的抗炎活性成分還應包含酚酸類和生物堿類等其他結構類型。