聯合X染色體多類遺傳標記應用于同父姐妹親緣關系鑒定實例

鞏五虎，薛少華，張 巖，林 源

（1.西安市公安局刑事偵查局技術處，陜西 西安 710038；2.司法鑒定科學研究院 上海市法醫學重點實驗室上海市司法鑒定專業技術服務平臺，上海200063）

1 案例

1.1 簡要案情

兩名女性（全文用A和B進行標示）要求進行同父姐妹親緣關系鑒定，父母均已過世，且無任何其他直系親屬，無任何身份證明文件，如出生記錄、戶口記錄等。

常規檢測手段為采用X-STR檢測試劑盒對上述兩名個體DNA樣本進行分型檢測。采用商業化檢測試劑盒Investigator X-12試劑盒（德國凱杰公司）對12個X-STR基因座進行分型檢測[1]。檢測結果發現基因座DXS8378和HPRTB存在突變的可能性，分型信息見表1。由于基因座DXS8378和HPRTB分別為X染色上連鎖群1和連鎖群4的核心基因座，國內市場上推出的Goldeneye 17X試劑盒（北京基點認知生物有限公司）含有上述兩個基因座。兩個試劑盒檢測結果表明，相同基因座檢測結果一致，新增加的X-STR基因座分型在A和B個體中均檢見一個相同的等位基因。該案例依據現有檢測手段，無法做出肯定性的判斷結果。

表1 兩名女性個體（A和B）在12個X-STR基因座的分型結果

1.2 X-InDel位點的檢測信息

采用含有18個X染色體上Indel（Insertion-Deletion，Indel）位點的復合擴增體系對上述兩份DNA樣本進行分型檢測[2]。該復合擴增體系及應用已獲專利授權（ZL 2013 1 0161815.3）。PCR反應采用10μL擴增體系，其中，包括PCR反應緩沖液2 μL，引物混合物 1 μL，DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 0.5 ng，其余體積用去離子水補齊。反應體系在9700 PCR儀上進行擴增，PCR擴增參數為：95℃15 min；94℃30 sec、65℃90 sec、72℃、90 sec，共進行 30 個循環；60℃延伸60 min。PCR產物變性后在3130XL遺傳分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進行毛細管電泳，采用已授權分型文件進行等位基因結果判讀。兩份樣本在18個X-Indel的分型均檢見一個相同的等位基因。

1.3 X-SNP位點的檢測信息

為進一步獲取遺傳信息量，以更好地做出結果判斷，嘗試采用已完成驗證的高通量并行測序（Massive parallel sequencing， MPS）體系對 29個 XSNP位點進行分型檢測[3]。測序在Ion Torrent PGM（美國Thermo Fisher Scientific公司）完成，主要步驟包括文庫構建、文庫修飾及定量、文庫富集及定量、芯片loading及測序、數據分析。兩份樣本在29個X-SNP位點分型均檢見一個相同的等位基因。

1.4 基于MPS技術對X-STR測序檢測

針對Investigator X-12試劑盒中包含的12個X-STR基因座進行MPS文庫構建引物設計，其中DXS10134、DXS10079和 DXS10148基因座無法獲取理想的文庫構建引物，其余9個STR基因座引物信息見表2。測序在Ion Torrent PGM平臺進行，采用“PGM:Ion PGMTMTemplate OT2 400 Kit for Hi-QTM”模式進行400 bp文庫測序，芯片為314 V2。測序發現樣本A和B在9個X-STR基因座上檢見的相同等位基因序列結構一致，如DXS10101基因座相同等位基因29.2的序列結構均為[AAAG]3GAAAGAAG[GAAA]3A[GAAA]4AAGA[AAAG]5AAAAAGAA[AAAG]14AA，其中黑色加粗的堿基不納入重復結構計算[4]。

2 討論

由于女性個體含有兩條X染色體，男性個體只有一條X染色體，故X染色體遺傳標記具有伴性遺傳的特征，表現為性連鎖遺傳，以單倍體形式遺傳給子代，即母親可將兩條X染色體上的等位基因隨機地遺傳給子女，而父親X染色體上的等位基因則只能遺傳給女兒[1-2]。理論上同父姐妹樣本在X染色體上遺傳標記必然會檢見一個相同的等位基因。本案例特殊之處在于對X染色體上12個STR基因座的檢測中發現，其中兩個X-STR基因座基因分型均為純合子，存在一步突變的可能性。目前對于X染色體上遺傳標記的法醫學檢測試劑盒僅針對STR基因座展開，最多可以檢測17個X-STR基因座。為確保基因分型不存在等位基因漏檢現象，采用含有上述兩個基因座的其他生產廠商推出的試劑盒進行驗證。另外，對于X-STR遺傳標記的親權關系計算，無統一的算法及相關標準。當遇到類似本案例情況時，如何進一步增加遺傳信息檢測，獲取更為科學可靠的法醫學證據，值得進一步研究。

表2 9個X-STR文庫構建引物信息

本案例嘗試采用自行研發的基于毛細管電泳技術的X-Indel復合擴增體系對上述突變案例樣本進行了X染色體上遺傳信息的補充檢測，檢測結果不排除A與B個體屬于同父姐妹關系。Indel遺傳標記可分為插入和缺失兩種等位基因形式，本質上也屬于SNP位點，但是由于存在長度差異，可以在法醫學實驗室必備的遺傳分析儀上完成檢測，該技術易于在基層法醫DNA實驗室推廣。

另外，本研究采用MPS技術對X-SNP位點和X-STR基因座進行了測序檢驗。SNP在遺傳分析儀上采用SNPshot技術也可以完成，但是由于熒光素限制，對于引物設計存在梯度長度排布的要求，且應用于降解檢材效果不佳[5]。本次對29個X-SNP位點進行150bp以下的文庫構建，測序效果較好，且適用于降解檢材。檢測中可以對樣本進行并行檢測，且可以根據樣本數量進行不同容量芯片的選擇，最大程度上節約樣本。采用MPS技術對9個常用X-STR基因座進行并行測序檢測，檢測結果發現A與B個體在9個基因座上檢見的相同等位基因具有相同的序列結構，且測序序列上變異信息一致，進一步增加了遺傳證據。

上述檢測實例為如何在常規X-STR基因座檢測發生突變情況時進一步獲取遺傳證據提供了新的遺傳標記及新的技術手段。其中MPS技術在多位點、多樣本的并行檢測中展現出了優勢，為法醫學遺傳標記的高效檢測提供了一種新的思路，為非常規親緣關系鑒定提供了新的技術手段。