糖足顆粒劑外用對神經性糖尿病足大鼠模型的影響

毛黎黎，高曉斐，岳仁宋(.成都中醫藥大學臨床醫學院， 四川 成都 6007； .重慶市中醫院，重慶 40000； .成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 6007)

糖尿病高危足是糖尿病患者足部存在周圍神經病變或外周血管病變或皮膚病變，但無開放性病灶，伴有嚴重的足部潰瘍風險的糖尿病足早期病變的總稱，也就是處于糖尿病足Wagner分級法的0級[1]。處在糖尿病高危足期的患者多無明顯的不適，加之目前醫學界對該病的認識并不明確，無統一的防治標準[2-3]，致使糖尿病足部潰瘍的發生率日漸增長，糖尿病高危足的防治形勢日趨嚴峻。筆者針對糖尿病高危足的病理特點，結合多年臨床經驗，引入“未病先防”的思想，臨床上運用中藥糖足煎劑浴足治療糖尿病高危足，總有效率達92.3%，減慢或阻斷了糖尿病高危足發展成為足潰瘍的進程[4]。本研究意將糖足煎劑改為顆粒劑，藥物組成不變，以動物實驗評價該中藥的藥效動力學，以期為糖足顆粒劑的臨床大量使用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級SD大鼠50只，雄性，體質量180～220 g，購自簡陽達碩動物科技有限公司，由四川省實驗動物檢測中心檢測，許可證號SCXK(川)2013-24。所有動物均在SPF級動物實驗室里喂養，室內空氣流通良好，室溫(22±2)℃，相對濕度26%～30%。普通飼料喂養，自由飲水和攝食，適應性飼養7 d后進行正式實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

糖足顆粒劑藥物組成：黃芪、當歸、雞血藤、乳香、沒藥、忍冬藤、川芎。中藥均由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供，并由其制備成顆粒劑。黃芪含黃芪甲苷、毛蕊異黃酮及多糖類等，忍冬藤含綠原酸、馬錢苷及黃酮類化合物等，雞血藤含芒柄花素及多糖類，鑒于這些成分大多能溶于水，故將其采用水煎煮法提取。當歸含揮發油類、當歸多糖及水溶性成分阿魏酸等，川芎含揮發油類及酚酸類等，兩味藥材均含有揮發油，且其水溶性成分為主要有效成分，故先將藥材中的揮發油以水蒸氣蒸餾法提取，再加水煎煮剩余藥渣。乳香、沒藥為樹脂類中藥，粉碎成細粉后直接入藥。STZ，Sigma公司產品，批號WXBB4624V；精蛋白鋅重組人胰島素注射液，商品名為優泌林，禮來蘇州制藥有限公司產品，批號C093656A；二甲苯(批號WG0069530)、冰醋酸(批號1093651)，均為成都艾科達化學試劑有限公司產品；蘇木素-伊紅液，北京索萊寶科技有限公司產品，批號G1120；變色酸2R，成都格雷西亞化學技術有限公司產品，批號C0681840251。One-Touch-Ⅱ型血糖儀及血糖試紙，美國強生公司產品；MS9557型胰島素注射筆，美國禮來公司產品；HH.W21.600型電熱恒溫水箱，余姚市東方電工儀器廠產品；9030(A)101(A)-0(S)電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；BMJ-Ⅲ型包埋機、BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺、PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀，均為常州中威電子儀器廠產品；LEICA RM2245切片機，購自德國；ZT-12P2生物組織自動脫水機，孝感亞光醫用電子技術有限公司產品。

1.3 動物分組

將60只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組，模型對照組，蒸餾水組，糖足顆粒劑高、中、低劑量組6組，每組各10只。

1.4 模型的建立

1.4.1 STZ糖尿病模型的建立

禁食不禁水12 h，手術組一次性腹腔內快速注射STZ 2 μL/g。分別在注射STZ后第3 d、第5 d、第7 d檢測空腹血糖，空腹血糖≥13.9 mmol/L者為造模成功(餐后血糖>16.7 mmol/L[5])。此后每兩天采用斷尾取血法檢測各組大鼠的隨機血糖，給予血糖>25 mmol/L的大鼠胰島素注射，每天腹腔注射中效胰島素約4個單位[6]。每周稱量體質量1次。造模期間死亡大鼠6只，分別為模型對照組2只，糖足顆粒劑高劑量組1只，糖足顆粒劑中劑量組1只，糖足顆粒劑低劑量組2只。手術組剩余44只造模成功大鼠。死亡大鼠解剖未見臟器異常，估計死亡原因為STZ造模而致的低血糖。

1.4.2 神經性糖尿病足模型的建立

按照參考文獻[7]方法：將STZ糖尿病模型大鼠適應性飼養1周；以質量分數為100 g/L的水合氯醛0.3 μL/g 腹腔注射麻醉，取俯臥位，固定大鼠四肢；使用電推剪在左側大腿去毛；以左側大腿股骨的體表投影位置為骨性標志，在股骨外側淺層和股骨平行做縱形切開，切口長約1.5 cm；鈍性分離筋膜、股骨直肌和二頭肌肌間隙，暴露坐骨神經，盡量不損傷肌肉組織；沿坐骨結節向下約1 cm處用無齒鉗子鉗夾坐骨神經干，持續10 s，咬合2齒為度，間歇10 s，重復3次，鉗夾過程中不能將神經干夾斷，損傷寬度約為3 mm；鉗夾完成后，神經干由圓柱狀變為扁平狀，并且呈現半透明；損傷部位遠端用手術縫合線標記，將神經放回原肌層，縫合皮膚；大鼠右側大腿坐骨神經僅需打開肌層暴露后縫合。造模過程中死亡2只大鼠，其中蒸餾水組1只，糖足顆粒劑高劑量組1只。術后造模大鼠左側后爪展爪反射消失[8]。

1.5 給藥方法

根據體表面積換算法，糖足顆粒劑高、中、低劑量組的給藥量依次為4.08 ，2.04，1.02 μg/g 體質量，用溫蒸餾水12.5×10-3L(37～40 ℃)溶解后備用。將糖足顆粒劑均勻涂布于大鼠左側大腿裸露皮膚上，用紗布包裹并用無刺激醫用膠布固定，接觸1 h后洗凈。蒸餾水組同法給予等量等溫蒸餾水。正常對照組、模型對照組不予任何處理。每天給藥1 h，持續30 d。

1.6 檢測指標

1.6.1 大體觀察

術后每天觀察大鼠傷口愈合情況，是否有感染、化膿、潰爛，足部是否出現紅腫、潰爛，小腿肌肉萎縮程度和跛足行走狀態。處死大鼠后解剖觀察經鉗夾處理的坐骨神經形態變化。

1.6.2 坐骨神經功能指數(SFI)

以硬紙板制作兩端均不封口的暗箱，尺寸60 cm×15 cm×10 cm。實驗開始前在暗箱里放置與箱底面積相等的白紙，將大鼠雙后足浸沒在純黑墨水里，保證大鼠行走時能在紙面上留下清晰的黑色腳印。實驗開始，將1只用墨水處理過雙后足的大鼠從紙箱一端放入，驅使大鼠行走到另一端，然后撤出白紙，測量白紙上相對清晰的黑色腳印。分別于術后第2天、第2周和第4周進行SFI的測量和計算。根據沈江寧[9]改良的公式:SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EIT-NIT)/NIT-8.8。其中PL指足印長度，即足跟到足趾的最長距離；TS指足趾寬度，第一足趾到第五足趾的距離；IT是指中間足趾寬度，第二足趾到第四足趾的距離；E和N分別代表實驗側和正常側。正常SFI為0，神經功能完全喪失為-100[10]。

1.6.3 坐骨神經組織學觀察

術后第4周，測量完大鼠足跡并計算SFI后，腹腔注射100 g/L 水合氯醛(0.3 μg/g)以麻醉大鼠，待其全身松軟后，在術側坐骨神經遠端吻合口2 mm處切取再生神經約10 mm，FAA液固定48 h，切片脫蠟，變色酸2R染色 約10 min，2 g/L冰醋酸沖洗 2～3次，5 g/L亮綠冰醋酸染色10 min，自來水沖洗2 min，脫水封固。光鏡下觀察坐骨神經縱切面軸突再生和髓鞘形成情況。采用Mias 3.0圖形分析系統(由四川大學圖像圖形研究所提供)，隨機取5個視野，對軸突面積、髓鞘面積進行半定量分析。

1.6.4 雙側腓腸肌濕重

取坐骨神經后，從肌肉起止點分離、剪取雙側腓腸肌，小心清除多余組織，稱量、記錄手術側與正常側腓腸肌質量，并將同只大鼠的兩側肌肉濕重相對比，計算恢復率。腓腸肌濕重恢復率=左側腓腸肌濕重/右側腓腸肌濕重×100%。腓腸肌濕重恢復率可以間接反映神經再生的情況。

1.6.5 腓腸肌組織學觀察

迅速測量雙側腓腸肌濕重后，將術側腓腸肌用FAA液固定48 h，逐級以1 000 g/L、900 g/L、800 g/L、700 g/L酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規切片4 μm，蘇木素-伊紅液染色3 min。采用Mias 3.0圖形分析系統光鏡下觀察肌細胞生長情況。在每張切片上隨機選取50個橫紋肌細胞，采用半自動法測量每個肌細胞的最大橫徑，計算其均值作為每張切片的肌細胞直徑，進行分析。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠大體觀察

手術組大鼠皮膚切口愈合良好，均屬Ⅰ期愈合；術后1周左右，各組大鼠術側足趾大多呈現蒼白、無力，少數有紅腫、潰瘍現象出現。手術組大鼠跛行嚴重，術側小腿三頭肌體積均有不同程度縮小，糖足顆粒劑各劑量組萎縮程度較模型對照組和蒸餾水組輕。術后第4周，手術組神經鉗夾刺激處近側較正常對照組明顯變細，手術組各組間神經近側粗細相差不大。

2.2 各組大鼠SFI對比

5個手術組大鼠手術蘇醒后步態即表現為跛行，呈現顯著的坐骨神經功能損傷表現；術后第2天、第2周和第4周坐骨神經功能無明顯恢復跡象，SFI為-70～-100。步態實驗結果顯示：術后第2天各手術組大鼠術側腳印細長，腳趾與腳趾之間的空隙不明顯，對比正常側，PL明顯增長，TS明顯縮窄；術后第4周末，糖足顆粒劑各劑量組大鼠術側腳趾仍無法分開，腳印模糊，測量困難。SFI測定顯示：與正常對照組對比，同一時間點模型對照組、蒸餾水組和糖足顆粒劑各劑量組的SFI均上升，差別有統計學意義(P<0.05)。同一時間點糖足顆粒劑各劑量組的SFI與模型對照組對比，差別均無統計學意義(P>0.05)。同一時間糖足顆粒各劑量組間SFI對比，差別均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

組 別動物數術后第2天第2周第4周 正常對照組10-(3．61±2．34)-(5．21±2．24)-(3．45±2．76) 模型對照組8-(86．17±6．25)??-(85．94±11．64)??-(83．28±5．28)?? 蒸餾水組9-(87．26±7．35)??#-(85．46±7．88)??#-(83．58±5．56)??# 糖足顆粒高劑量組8-(87．78±2．18)??#△-(84．34±6．09)??#△-(84．68±8．62)??#△ 糖足顆粒中劑量組9-(87．48±5．12)??#△＊-(84．55±2．78)??#△＊-(84．18±5．22)??#△＊ 糖足顆粒低劑量組8-(87．48±5．85)??#△＊▲-(84．26±13．28)??#△＊▲-(83．31±9．32)??#△＊▲

注：與正常對照組對比，**P<0.05；與模型對照組對比，#P>0.05；與蒸餾水組對比，△P>0.05；與糖足顆粒高劑量組對比，＊P>0.05；與糖足顆粒中劑量組對比，▲P>0.05

2.3 各組大鼠坐骨神經組織學對比

光學顯微鏡下：正常對照組神經纖維髓鞘形態完整，排列有序、致密，厚薄比較均勻；模型對照組坐骨神經損傷遠端軸突面積增多、形態不規則、排列混亂，髓鞘幾乎消失；蒸餾水組坐骨神經損傷形態與模型對照組相似；糖足顆粒劑高劑量組新生纖維較多，有髓神經纖維比例增多, 排列緊密；糖足顆粒劑低劑量組出現新生纖維，有髓神經纖維比例增多，排列較整齊；糖足顆粒劑中劑量組坐骨神經組織學形態介于糖足顆粒劑高、低劑量組之間。與正常對照組對比，各手術組髓鞘面積總和減小，差別有統計學意義(P<0.05 )；軸突面積總和大小不一，差別無統計學意義(P>0.05)。與模型對照組對比，蒸餾水組和糖足顆粒各劑量組的髓鞘面積總和減小，差別有統計學意義(P<0.05 )，軸突面積總和差別無統計學意義(P>0.05)。與蒸餾水組對比，糖足顆粒各劑量組的髓鞘面積總和、軸突面積總和差別無統計學意義(P>0.05)。糖足顆粒各劑量組間的髓鞘面積總和、軸突面積總和對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組 別動物數髓鞘面積總和軸突面積總和 正常對照組10191．42±34．55128．61±9．21 模型對照組8109．22±53．76??134．57±117．56? 蒸餾水組953．84±14．31??##133．13±22．75?# 糖足顆粒高劑量組854．15±12．64??##△131．45±37．53?#△ 糖足顆粒中劑量組955．46±16．26??##△＊132．55±46．29?#△＊ 糖足顆粒低劑量組854．18±23．26??##△＊▲132．72±21．89?#△＊▲

注：與正常對照組對比，*P>0.05，**P<0.05；與模型對照組對比，#P>0.05，##P<0.05；與蒸餾水組對比，△P>0.05；與糖足顆粒高劑量組對比，＊P>0.05；與糖足顆粒中劑量組對比，▲P>0.05

2.4 各組大鼠腓腸肌濕重恢復率對比

肉眼大體觀：正常對照組大鼠雙側腓腸肌肌肉最飽滿，富有光澤與彈性。各手術組中糖足顆粒劑高劑量組大鼠術側腓腸肌肌肉最飽滿，最有光澤，觸之有彈性；糖足顆粒劑中、低劑量組次之；蒸餾水組再次之；模型對照組最差。糖足顆粒劑3個劑量組的腓腸肌濕重恢復率分別與蒸餾水組、模型對照組對比，差別均有統計學意義(P<0.05)。糖足顆粒劑中、低劑量組的腓腸肌濕重恢復率與高劑量組對比，差別有統計學意義(P<0.05)；低劑量與中劑量組對比，差別無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組 別動物數腓腸肌濕重恢復率 正常對照組1096．80±3．11 模型對照組830．85±4．63? 蒸餾水組939．56±5．33?# 糖足顆粒高劑量組861．90±4．55?#△ 糖足顆粒中劑量組953．73±8．12?#△＊ 糖足顆粒低劑量組846．90±6．89?#△＊▲

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與蒸餾水組對比，△P<0.05；與糖足顆粒高劑量組對比，＊P<0.05；與糖足顆粒中劑量組對比，▲P>0.05

2.5 各組大鼠腓腸肌組織學對比

光學顯微鏡下觀察：正常對照組肌纖維飽滿，排列規則。模型對照組的肌纖維直徑較正常對照組顯著縮短，肌纖維不飽滿，顯著皺縮，排列無規則，大多數細胞核游離于肌細胞之外，細胞間隙顯著增加，肌纖維細胞整體呈現顯著萎縮變性狀態。糖足顆粒劑各劑量組肌纖維形態較規則，細胞間隙縮短。糖足顆粒劑高劑量組可見大部分肌細胞飽滿，細胞核仍緊貼于肌纖維的周邊，細胞間隙變小，肌纖維細胞整體呈現輕度萎縮變性狀態。糖足顆粒劑低劑量組與模型對照組對比，肌纖維直徑稍增大，形態較飽滿，肌細胞核丟失不嚴重，細胞間隙減小，肌纖維萎縮變性狀態減輕。糖足顆粒劑中劑量組肌細胞改變介于糖足顆粒劑高、低劑量組之間。與正常對照組對比，5個手術組大鼠的腓腸肌肌細胞直徑減小，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，糖足顆粒劑各劑量組腓腸肌肌細胞直徑增大，差別均有統計學意義(P<0.05)。與蒸餾水組對比，糖足顆粒劑各劑量組肌細胞直徑增大，差別有統計學意義(P<0.05)。與糖足顆粒劑高劑量組對比，差別無統計學意義(P>0.05)；與糖足顆粒中劑量組對比，糖足顆粒低劑量組肌細胞直徑無顯著增加，差別無統計學意義(P>0.05)。見表4。

組 別動物數直徑/μm 正常對照組1069．10±1．09 模型對照組838．01±16．04? 蒸餾水組930．05±3．59? 糖足顆粒高劑量組856．34±12．65?# 糖足顆粒中劑量組950．46±6．26?#△＊ 糖足顆粒低劑量組849．19±8．39?#△＊▲

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05；與蒸餾水組對比，#P<0.05；與糖足顆粒高劑量組對比，＊P>0.05；與糖足顆粒中劑量組對比，▲P>0.05

3 討 論

糖足顆粒劑是專門用于治療糖尿病高危足的中藥復方，由黃芪、當歸、雞血藤、乳香、沒藥、忍冬藤、川芎7味中藥組成，具有溫經通絡、活血化瘀的作用。

在本實驗中，進行坐骨神經夾傷后，糖尿病大鼠表現出：術側足趾蒼白、無力，少數出現紅腫、潰瘍的現象，且術側小腿三頭肌體積均有不同程度縮??；步態表現為跛行，坐骨神經功能術后第2天SFI均在-70～-100。腓腸肌組織學觀察示：肌纖維細胞整體呈現顯著萎縮變性狀態。坐骨神經組織學觀察示：神經細胞脫髓鞘，軸突面積增多、形狀不規則、排列混亂。糖足顆粒劑治療組在進行了1個月的糖足顆粒劑溫敷后，術側小腿三頭肌雖肉眼觀察恢復不明顯，但腓腸肌濕重恢復率有所升高，糖足顆粒劑各劑量組的恢復率高于蒸餾水對照組，差別有統計學意義(P<0.05)；光鏡觀察肌纖維呈現輕度萎縮變性狀態，糖足顆粒劑治療組與蒸餾水對照組對比，肌細胞直徑有所增加，差別有統計學意義(P<0.05)。但是，在坐骨神經功能和坐骨神經組織學觀察上，糖足顆粒劑各劑量組的恢復與對照組無明顯差別。也就是說，經過1個月的糖足顆粒劑治療，治療組大鼠的皮膚和腓腸肌有明顯恢復，而遭到破壞的神經則恢復不明顯。由于實驗條件限制，沒有進行大鼠足部血管形態觀察。根據實驗現象和數據，實驗者猜測原因在于：糖足顆粒劑復方通過改善大鼠足部血管功能，使肌肉和神經內因高糖環境導致的血管形態改變[11-12]有所恢復，微血管功能障礙減少，增加肌肉、神經血流和含氧水平，營養肌細胞和神經纖維細胞，在一定程度上改善了肌細胞和神經纖維細胞的功能。

4 參考文獻

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通信作者：岳仁宋，教授，主任醫師，成都中醫藥大學附屬醫院，四川省成都市金牛區十二橋路39號，610072，1580229694@qq.com

*基金項目：四川省干保科研課題(H2017033)；成都中醫藥大學附屬醫院基金(2016-D-YY-01)