探究化學(xué)試劑與天然植物在螨污染培養(yǎng) 基熏蒸除螨法中的應(yīng)用*

王彥芳，張 發(fā)，劉碩然，楊曉燕*

(1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003；2.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224)

螨是節(jié)肢動(dòng)物門(mén)蛛形綱一類(lèi)體型極小、繁殖率高、發(fā)育周期短、活動(dòng)范圍小、肉眼難以直接看到的有害生物[1]。其種類(lèi)繁多，分布廣泛，遍及各種土壤、水體、生物體及貯藏的食品、居室用品和藥用食材等。據(jù)估計(jì)，全球螨類(lèi)有50萬(wàn)種之多，已有記錄的將近5萬(wàn)種，分屬于284個(gè)科。螨的形體多介于0.1―0.5mm，成熟的螨有8只足，行動(dòng)速度達(dá)72m/h，可攜帶細(xì)菌、真菌、衣原體等病原體，是傳播病菌的媒介。它的糞便、足及其身上的剛毛都是真菌的載體，伴隨著真菌自身的快速繁殖，兩者互為促進(jìn)因子，螨危害及有害真菌會(huì)迅速得以擴(kuò)散[2―3]。

長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)螨的防治主要依賴(lài)化學(xué)藥劑，化學(xué)藥物殘留、毒性和易產(chǎn)生耐藥性等弊病，其使用受到越來(lái)越多的限制。同時(shí)藥物對(duì)環(huán)境生態(tài)的不良影響也引起人們的關(guān)注[4―7]。植物精油是植物的次生代謝物質(zhì)，是一種在常溫下能揮發(fā)、具有一定芳香氣味的油狀液體物質(zhì)。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)植物精油可以用來(lái)驅(qū)蟲(chóng)、殺蟲(chóng)和防蟲(chóng)，因此利用低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性的天然植物控制螨危害越來(lái)越受到人們的重視[7―12]。

在食線蟲(chóng)真菌的相關(guān)研究過(guò)程中，螨蟲(chóng)可以隨著土壤、空氣和牙簽等進(jìn)入培養(yǎng)基且可直接取食真菌孢子，破壞培養(yǎng)基，造成培養(yǎng)基污染，已經(jīng)嚴(yán)重影響到食線蟲(chóng)真菌的相關(guān)研究。因此，尋找一種適合實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)基中螨污染的有效殺螨方法，是食線蟲(chóng)真菌研究中亟待解決的問(wèn)題。本項(xiàng)目對(duì)市面上的3種化學(xué)藥劑和3種植物精油的殺螨效果進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出最佳殺螨方法。研究結(jié)果可為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)螨蟲(chóng)污染的處理提供參考。

1.材料和方法

1.1驗(yàn)材料和儀器

化學(xué)藥劑：雙甲脒(江蘇歐克動(dòng)物藥業(yè)有限公司，20%乳油)；吡蟲(chóng)啉(浙江龍游東方阿納薩克作物科技有限公司，70%可濕性粉劑)；害極滅(美國(guó)默沙東藥廠，1.8%乳油)。

植物精油：冬青油(生產(chǎn)商：中國(guó)廣州南方化妝品有限公司；純度：97%)；香茅油(生產(chǎn)商：嘟嘟媽和太古の手工坊；純度：100%)；樟腦油(生產(chǎn)商：吉安市百草天然香料有限公司；純度：100%)。

1.2培養(yǎng)基制備

玉米粉瓊脂固體培養(yǎng)基(CMA)的配置參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.3螨蟲(chóng)分離及鑒定

隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)食線蟲(chóng)真菌的培養(yǎng)基在體視鏡下觀察，挑取螨的成蟲(chóng)及蟲(chóng)卵轉(zhuǎn)接到長(zhǎng)滿(mǎn)食線蟲(chóng)真菌且未被污染的培養(yǎng)基上，放置到25±5℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d后。在體視鏡下觀察，用濕毛筆粘取螨的成蟲(chóng)至75%酒精中，制成標(biāo)本，40X顯微鏡下觀察，與中國(guó)東北土壤革螨[1]進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定到種。

1.4試驗(yàn)方法

室內(nèi)殺螨試驗(yàn)全部采用熏蒸法：挑取生長(zhǎng)發(fā)育一致的實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)螨30只，背部粘于貼有雙面膠紙的載玻片上，放置于容量為1000mL的廣口瓶中，取5μL的供試樣品注射于磨口瓶塞內(nèi)壁上，在瓶塞外壁周邊涂抹凡士林，以防螨蟲(chóng)爬出，迅速蓋上瓶塞，25±1℃溫度條件下熏殺24h，揭蓋散氣1h，取出鏡檢，統(tǒng)計(jì)死亡率[14]。死亡率按算術(shù)平均值計(jì)算，并用空白對(duì)照死亡率計(jì)算校正死亡率。

1.4.1化學(xué)藥劑殺螨 設(shè)3組實(shí)驗(yàn)組和1組對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別為雙甲醚組、吡蟲(chóng)啉組、害極滅組，每組設(shè)6個(gè)濃度梯度(1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L)，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組熏蒸劑為無(wú)菌水，設(shè)3組重復(fù)，熏蒸法同上。上述試驗(yàn)中的每個(gè)重復(fù)蟲(chóng)體數(shù)均為30只。

1.4.2植物精油殺螨 設(shè)3組實(shí)驗(yàn)組，分別為樟腦油組、冬青油組和香茅油組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)蟲(chóng)體數(shù)均為30只。采用熏蒸法進(jìn)行殺螨。對(duì)照組同1.4.1。

1.5數(shù)據(jù)處理

殺螨率(%)=[1-(檢測(cè)螨蟲(chóng)數(shù)-死亡螨蟲(chóng)數(shù))/檢測(cè)螨蟲(chóng)數(shù)]×100%[15]。

全部數(shù)據(jù)的處理采用SPSS軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，并采用鄧氏新復(fù)極差法來(lái)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

2.結(jié)果

2.1螨蟲(chóng)鑒定結(jié)果

采得的螨蟲(chóng)經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定共有3種：王氏伊綏螨Iphiseiuswangi(Yin，Bei et Lv，1992)；易變革板螨Gamasholaspisvariabilis(Petrova，1967)；松江廣厲螨Cosmolaelapssungaris(Ma，1996)。實(shí)驗(yàn)室中I.wangi出現(xiàn)頻率最高，易于培養(yǎng)繁殖，因此選用I.wangi為主要供試樣本。

2.2不同濃度化學(xué)藥劑對(duì)螨的致死效果比較

不同濃度化學(xué)藥劑對(duì)螨的致死結(jié)果見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析表明，3種藥劑在不同濃度下的殺螨率差異顯著。在相同濃度條件下雙甲脒的殺螨率較高。在藥劑濃度為30mmol/L，熏殺24h的情況下，3種藥劑殺螨效果均較好，其中雙甲脒的殺螨活性最高，高達(dá)94.44%。

表1 不同濃度下3種化學(xué)藥劑對(duì)螨的致死率

注:平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)字后不同字母表示差異達(dá)5%差異水平。

2.3不同植物精油殺螨效果比較

植物精油殺螨效果如表2所示，三者的殺螨率差異不大。植物精油24h熏蒸死亡率均在95%以上，殺螨活性較高，其中冬青油的殺螨率最高，可達(dá)到100%。

表2 不同植物精油的殺螨率

注:平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列數(shù)字后不同字母表示差異達(dá)5%差異水平。

3.分析與討論

在食線蟲(chóng)真菌的研究過(guò)程中，由于需要從不同來(lái)源的土壤、糞便、腐木等樣品中分離菌種資源，由此帶來(lái)的螨蟲(chóng)污染是食線蟲(chóng)真菌研究所面臨的較為嚴(yán)峻的問(wèn)題。本研究從培養(yǎng)基中分離到三種螨蟲(chóng)(I.wangi，G.Variabilis，C.sungaris)，其中常見(jiàn)的螨為I.wangi。I.wangi通過(guò)土壤、糞便、腐木等不同樣品帶入實(shí)驗(yàn)室后，可經(jīng)牙簽攜帶、爬行等方式進(jìn)入各種環(huán)境中，在培養(yǎng)基內(nèi)造成培養(yǎng)基污染，同時(shí)螨會(huì)以食線蟲(chóng)真菌的分生孢子為食，這也增加了菌株分離、純化和保存的難度。

雙甲脒、吡蟲(chóng)啉和害極滅均具有胃毒和觸殺作用[16―19]。雙甲脒、吡蟲(chóng)啉、害極滅由于高效、廣譜、低毒、低殘留且價(jià)格低廉等特點(diǎn)，是目前常用的殺螨劑[18―22]；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在藥劑濃度為30mmol/L，熏殺24h的情況下，雙甲脒的殺螨活性最高(94.44%)，其次是吡蟲(chóng)啉(82.22%)，害極滅最低(71.11%)。市面上的雙甲脒藥劑大多是安瓿瓶裝的20%乳劑，有刺激性氣味，使用后不便存放；吡蟲(chóng)啉雖然比雙甲脒殺螨率低，但它是袋裝可濕性粉劑，無(wú)味且使用后方便存放；害極滅有刺激性氣味，經(jīng)口毒性大，且對(duì)水生生物有毒[23]。因此，針對(duì)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基內(nèi)螨污染的殺螨推薦使用濃度為30mmol/L吡蟲(chóng)啉，熏殺24h。

本研究結(jié)果顯示，與化學(xué)藥劑相比，各植物精油(香茅油、冬青油、樟腦油)的螨蟲(chóng)致死率均在95%以上，殺螨效果較為理想，與LubbeAndrea和Verpoorte Robert[24]的結(jié)果一致。但是植物精油殺螨存在許多問(wèn)題，如易揮發(fā)、生物活性物質(zhì)種類(lèi)多樣、提取過(guò)于繁雜、制作成本高且價(jià)格昂貴，對(duì)空氣、日光及溫度較敏感，易分解變質(zhì)等[24―27]，因此，即使殺螨效果最佳但仍需考慮其實(shí)用性，所以化學(xué)藥劑在殺螨過(guò)程中的地位不可忽視。植物精油是一類(lèi)復(fù)雜化合物，其殺螨活性的有效成分分離鑒定和作用機(jī)理仍有待深究。在以后的研究工作中可進(jìn)一步研究精油與化學(xué)藥劑合用或幾種精油合用殺蟲(chóng)是否存在增效或拮抗作用，使精油作為輔助因子在減輕藥劑毒性與殘留上增強(qiáng)殺蟲(chóng)效果。

在實(shí)踐中，針對(duì)小面積殺螨，如培養(yǎng)基的螨污染問(wèn)題，優(yōu)先推薦使用冬青油熏殺，或者使用香茅油、樟腦油和濃度為30mmol/L吡蟲(chóng)啉熏殺，可以更快、更有效的對(duì)螨病害進(jìn)行防治。