4-苯基丁酸對大鼠膿毒癥的保護作用

朱 娛，吳 躍，田昆侖，彭小勇，張 杰，劉良明，李 濤

膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克常見的并發癥，是創傷、燒傷患者死亡的重要原因之一[1-2]。據報道，全世界每天約有1 400人死于膿毒癥。在美國的統計分析中，膿毒癥每年有75萬病例，其中約22萬～25萬人死亡，并呈逐年上升趨勢，是非心臟重癥監護病房(ICU)患者的主要死亡原因[3-4]。因此對膿毒癥患者的治療顯得尤為迫切。盡管近年來采取了許多新的治療措施，但膿毒癥的發生率和病死率仍居高不下。

內質網應激(ERS)是由某種原因導致內質網生理功能發生紊亂，是一種亞細胞器的病理過程，可促進內質網的錯誤折疊，從而有利于維持細胞的正常功能，但長時間的ERS可引起細胞凋亡等細胞功能損傷。ERS參與多種疾病的發生、發展過程，適度的ERS可以恢復心肌細胞鈣和蛋白質合成穩態，有利于肥大心肌的修復與代償；但持續而嚴重的ERS可觸發內質網應激相關細胞凋亡，誘導肥大心肌轉向衰竭[5]。內質網應激抑制劑4-苯基丁酸(PBA)是美國FDA于1996年批準上市的新藥，是一種相對分子質量較低的脂肪酸，目前已用于臨床治療兒童尿素循環衰竭[6]、鐮刀狀紅細胞病和地中海貧血[7]。以往研究顯示，PBA在多種疾病中對器官功能有明顯的保護作用，包括帕金森病、糖尿病及高血壓等。Luo等[8]發現PBA 通過抑制內質網應激介導的凋亡起到抑制心臟缺血的損害作用。Mosbah等[9]發現PBA可通過抑制內質網應激介導的凋亡保護肝臟發生缺血再灌注損傷。但PBA是否對膿毒癥大鼠有治療作用，目前尚不清楚。為此，本實驗采用盲腸結扎穿孔術(CLP)復制大鼠膿毒癥模型，觀察PBA對膿毒癥大鼠組織灌注、器官功能以及存活時間、存活率的影響，為膿毒癥的救治提供新的方向。

材料與方法

1 膿毒癥模型的建立

160只SD大鼠，雌雄不拘，體重220g左右，由陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。用盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型：常規腹部消毒，暴露盲腸，在其末端1/2處結扎，貫通穿刺結扎部位，讓糞便流入腹腔，常規縫合、飼養。CLP制作12h后插管監測平均動脈血壓(mean arterial blood pressure,MAP)，當MAP下降30%或以上，認為模型成功，本實驗模型成功率為70%。股靜脈插管用于輸液，插管完成后穩定10min。從插管中注入500U/kg的肝素鈉全身抗凝。假手術組大鼠除不結扎盲腸和穿孔外, 其余操作同膿毒癥模型組。

2 試劑

PBA購自Sigma公司，貨號P21005，規格25g，分子量為164.2g/mol。稱取250mg PBA，溶于10mL雙蒸水中，母液濃度為25mg/mL，使用時用雙蒸水稀釋10倍，即2.5mg/mL，每100g大鼠給0.2mL。

3 PBA對膿毒癥大鼠的保護作用

實驗分為假手術組、膿毒癥組、常規治療組、PBA早期治療組(Ear-PBA組)和PBA晚期治療組(Lat-PBA組)。常規治療組：根據膿毒癥救治指南，在CLP 12h后靜脈給予乳酸林格氏液(LR)、抗生素頭孢呋辛鈉(100mg/kg)和血管活性藥物多巴胺，輸液速度為10μg/(kg·min)，輸注6h，使MAP>70mmHg；Ear-PBA組：在CLP手術完成后立即尾靜脈給予PBA(5mg/kg)，在CLP 12h后常規治療6h；Lat-PBA組：在CLP 12h后給予常規治療的同時給予PBA(5mg/kg)股靜脈輸注6h；膿毒癥組：在CLP 12h后直接觀察相關指標；假手術組除了不結扎盲腸和穿孔以外，其他操作與膿毒癥模型組一致。實驗分為三批，第一批用于觀察存活時間、存活率，每組16只，實驗結束后，結扎血管，縫合皮膚，肌注抗生素頭孢呋辛鈉；用苦味酸在動物的耳朵進行標記，然后將實驗大鼠放回籠中，給予飼料和水，每30min觀察1次，詳細記錄動物的狀態和死亡時間。第二批(每組8只)用于觀察組織灌注，剪開大鼠腹直線，暴露所測器官，用激光多普勒(PF5001)探針垂直插入0.5cm，待曲線穩定后記錄并測定。第三批(每組8只)用于測定器官功能，抽取2mL動脈血用生化分析儀(BXC800，Beckman，美國)檢測腎臟功能，包括血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、β2-微球蛋白(β2-MG)和視黃醇結合蛋白(RBP)以及用ELISA試劑盒檢測腸道功能，包括D-乳酸(D-lactate)和內毒素(endotoxin)。

4 統計學分析

結 果

1 PBA對膿毒癥大鼠存活時間及存活率的影響

CLP 12h超過一半的動物在6h內死亡，無動物存活時間超過72h，其平均存活時間約6.21h；常規治療后，動物的存活無顯著變化，其平均存活時間為7.44h，無動物存活時間超過72h；給予PBA后，動物存活時間明顯延長，其中PBA早期治療組的存活時間為16.32h，72h存活率25%；PBA晚期治療組存活時間為13.11h，72h存活率為31%。見圖1。

圖1 PBA對膿毒癥大鼠存活時間及存活率的影響。與常規治療組比較：@P<0.05，@@P<0.01；sepsis：膿毒癥組；CT：常規治療組；Ear-PBA：PBA早期治療組；Lat-PBA：PBA晚期治療組

2 PBA對膿毒癥大鼠腎臟血流量和腸道血流量的影響

與假手術組比較，膿毒癥大鼠的腸道和腎臟血流量均顯著降低，常規治療后腸道和腎臟血流量有部分升高，約為112U/min和190U/min；PBA早期和晚期治療組器官血流量均顯著增加，其中PBA早期治療組的腸道和腎臟血流量分別為143U/min和274U/min；PBA晚期治療組腸道和腎臟血流量分別為147U/min和243U/min，與常規治療組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 PBA對膿毒癥大鼠腸道和腎臟血流量的影響。與假手術組比較：**P<0.01；與膿毒癥組比較：#P<0.05；與常規治療組比較：@P<0.05，@@P<0.01；CT：常規治療組；Ear-PBA：PBA早期治療組；Lat-PBA：PBA晚期治療組

3 PBA對膿毒癥大鼠腎臟功能的影響

膿毒癥后大鼠腎臟功能明顯受損，反映腎臟功能的指標包括BUN、Scr、β2-MG和RBP在膿毒癥后均顯著高于基礎值(P<0.01)；常規治療可部分降低膿毒癥大鼠血漿中的BUN、Scr、β2-MG和RBP的水平；PBA治療后，大鼠腎臟功能明顯改善，血漿中的Scr、β2-MG和RBP明顯降低，與常規治療組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，其中PBA早期治療效果優于PBA晚期治療(表1)。

表1 PBA對膿毒癥大鼠腎臟功能的影響

與膿毒癥組比較：#P<0.05，##P<0.01；與常規治療組比較：@@P<0.01；BUN：尿素氮；Scr：血肌酐；β2-MG：β2-微球蛋白；RBP：視黃醇結合蛋白

4 PBA對膿毒癥大鼠腸道功能的影響

與假手術組相比，膿毒癥后腸道功能明顯受損，反映在D乳酸和內毒素顯著升高(P<0.01)；常規治療可降低膿毒癥大鼠血漿中D-乳酸和內毒素的水平，但差異無統計學意義；不管是PBA早期治療或是晚期治療，大鼠血漿中的D-乳酸和內毒素含量均明顯下降，與常規治療組相比，PBA早期治療下降幅度分別為37%和20%；PBA晚期治療下降幅度分別43%和42%(P<0.01)。見表2。

表2 PBA對膿毒癥大鼠腸道功能的影響

與膿毒癥組比較：#P<0.05，##P<0.01；與常規治療組比較：@@P<0.01

討 論

膿毒癥是全身炎癥反應綜合征，是嚴重創傷和休克最易出現的并發癥之一，是創傷和休克主要的死亡原因[2]，也是ICU死亡率最高的疾病之一[10]。盡管近年來對膿毒癥的研究不斷深入，但其死亡率始終居高不下[11]。盡管采取了相應的治療措施，但臨床效果不明顯，因此尋找有效的治療藥物對膿毒癥具有重要的意義。PBA作為內質網應激的抑制劑，近年來在缺血缺氧和缺血再灌注損傷中有廣泛的研究，但PBA對膿毒癥大鼠是否有保護作用，目前尚不清楚。本研究通過CLP模型復制膿毒癥來觀察PBA對膿毒癥大鼠的保護和治療作用。結果發現：膿毒癥后大鼠的器官功能嚴重受損、組織血流量顯著降低、動物的存活時間縮短和存活率降低；常規治療(包括液體復蘇、抗感染以及使用血管活性藥物)可適當延長動物的存活時間和存活率；PBA早期和晚期治療可顯著改善器官功能，增加組織血流量，提高動物的存活時間和存活率。本實驗結果發現PBA對膿毒癥有一定的保護和治療作用，為膿毒癥的救治帶來新的方向。

PBA是一種口服的芳香脂肪酸，因為具有光譜的藥理性質，已被用于治療多種疾病，如尿酸代謝紊亂、β-地中海貧血、二型糖尿病和家族性高膽固醇血癥。近年來發現PBA具有抗內質網特性，可降低肺動脈高壓[12]。目前研究顯示PBA可抑制細胞凋亡，減輕器官損傷，其主要機制與抑制內質網應激相關，抑制caspase3和caspase9的表達[13]；PBA還可減輕炎癥反應，主要是通過抑制氧化應激，減少炎癥轉錄因子NF-κB的表達[14-15]；此外PBA作為一種分子伴侶，具有穩定蛋白質結構和改善內質網功能的作用[7]。

綜上所述，PBA能夠通過增加腎臟、腸道血流量，改善器官功能從而增加膿毒癥大鼠的存活率，延長存活時間，對膿毒癥大鼠有明顯的保護作用。但PBA是如何發揮對膿毒癥大鼠的保護作用，其具體機制有待進一步研究。

盡管筆者發現PBA可保護膿毒癥大鼠的器官功能，但是否對膿毒癥患者也有保護作用，需進一步確定；本實驗只研究了PBA對膿毒癥大鼠的保護作用，其機制如何，還需進一步研究。