利用熒光定量PCR技術(shù)篩查新生兒和嬰幼兒巨細(xì)胞病毒感染水平及探討與肝臟損害的相關(guān)性及治療研究

唐銘 寧云云（通訊作者）

（睢寧縣人民醫(yī)院 江蘇 徐州 221200）

人巨細(xì)胞病毒（HCMV）感染是小兒常見感染性疾病，重者可累及多臟器系統(tǒng)，特別是肝臟，是造成先天性畸形及新生兒死亡的重要原因[1]。近年，隨著熒光定量PCR技術(shù)、HCMV早期診斷試劑盒的使用及推廣，熒光定量PCR診斷HCMV感染為本病相關(guān)治療提供了有力依據(jù)，文章現(xiàn)以我院近年收治HCMV感染患兒為例，對本病臨床診治及與肝損害相關(guān)性進(jìn)行分析探討，具體報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

以2017年5月—2018年3月我院42例HCMV感染患兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HCMV感染診斷符合中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會感染消化學(xué)組制定的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床資料齊全；③簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒溶血；②非HCMV感染所致肝功能損害；③不合格檢測樣本。入選病例中，男21例，女21例；年齡0～6個月，平均（2.7±1.2）月。

1.2 方法

患兒入院后均抽取靜脈血液樣本，以全自動生化分析儀測定肝功能指標(biāo)血清總膽紅素（TBIL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）。ALT升高者，取患兒中段尿液1ml，以熒光定量PCR技術(shù)對HCMV-DNA做進(jìn)一步檢測。檢測方法：尿液樣本常規(guī)上機離心5min，沉淀后加DNA提取液50μl，充分混勻后再次上機離心5min，取含病毒DNA的上清液，常規(guī)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR擴增）。設(shè)陽性定量質(zhì)控參考品梯度、陰性質(zhì)控品、未知標(biāo)本，設(shè)置循環(huán)條件，按照試劑盒提供定量陽性標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，由電腦自動分析計算定量結(jié)果。根據(jù)肝功能指標(biāo)測定結(jié)果及PCR檢測結(jié)果予以患兒還原谷胱甘肽保肝、更昔洛韋抗病毒等對癥治療。

1.3 觀察指標(biāo)與評價標(biāo)準(zhǔn)

以臨床綜合診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評價熒光定量PCR技術(shù)診斷HCMV感染的準(zhǔn)確性。觀察患兒治療前后肝功能指標(biāo)改善情況，評價臨床療效。評價標(biāo)準(zhǔn)[2]：顯效：HCMVDNA轉(zhuǎn)陰，相關(guān)癥狀消失，肝功能正常。顯效：HCMV-DNA仍呈陽性，但拷貝數(shù)較前減少，相關(guān)癥狀顯著改善，肝功能恢復(fù)。無效：療效未至上述標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

以SPSS17.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料±標(biāo)準(zhǔn)差表示，t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

全部患兒尿液樣本熒光定量PCR診斷HCMV-DNA均呈陽性，以臨床綜合診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確率100%。經(jīng)治療，42例患兒中，顯效15例，有效24例，無效3例，治療總有效率92.86%?；純褐委熐昂蟾喂δ苤笜?biāo)見表1。統(tǒng)計顯示，患兒治療后肝功能指標(biāo)較治療前均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 患兒治療前后肝功能指標(biāo)變化

3.討論

熒光定量利用熒光信號積累實時監(jiān)測PCR進(jìn)程并對未至模板進(jìn)行定量，具有敏感性高、樣本需求量少、快速簡便等優(yōu)點、研究指出，以熒光定量PCR技術(shù)診斷HCMV感染，使用外周血液樣本、尿液樣本均可，只需基因片段5～50個，4～6h即可除檢測結(jié)果，極大的縮短了HCMV感染診斷窗口期，對本病早期確診具有重要意義[3]。另外，熒光定量PCR自動化診斷也排除了人為因素對檢測結(jié)果的干擾，大大提高了診斷準(zhǔn)確性，能夠真實反映病毒DNA復(fù)制情況，用以判斷感染嚴(yán)重程度，從而指導(dǎo)臨床治療及預(yù)后評估。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計。超過50%的嬰肝綜合癥由HCMV感染所引起，考慮原因為小兒肝膽發(fā)育不熟，HCMV感染后最易累及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，同時病毒侵襲膽管上皮細(xì)胞引起膽道梗阻，導(dǎo)致TBIL及肝酶排泄障礙，從而引起癥狀[6]。但當(dāng)感染活動期得到有效控制，患兒肝功能指標(biāo)異常可有效解除或顯著改善，因此，臨床也常以患兒肝功能指標(biāo)作為HCMV感染診斷、治療及預(yù)后評估的重要依據(jù)。

目前，臨床尚無HCMV感染特效治療方法，臨床治療以對癥處理及支持治療為主。《兒童巨細(xì)胞病毒性疾病診斷和防治指南》（以下簡稱指南）中指出：免疫正常個體的無癥狀或輕度癥狀HCMV感染無需抗病毒治療，有明顯HCMV性疾病者，尤其是免疫抑制個體，予以抗病毒感染治療。本次臨床研究血生化測定患兒肝功能指標(biāo)，異常者還原型谷胱甘肽保肝治療，復(fù)查轉(zhuǎn)氨酶下降，巨細(xì)胞拷貝數(shù)減少者，不予以特殊治療，如復(fù)查示指標(biāo)值明顯升高，則考慮肝功能損傷加重，予以更昔洛韋治療，符合相關(guān)治療標(biāo)準(zhǔn)。

更昔洛韋具有光譜抗皰疹病毒活性，適用于預(yù)防及治療多種類型的巨細(xì)胞病毒感染，能直接滲入HCMV-DNA阻斷病毒DNA鏈或通過競爭性抑制HCMV-DNA多聚酶合成來發(fā)揮活性作用。目前，更昔洛韋治療HCMV感染以抗原轉(zhuǎn)陰為治療目標(biāo)，臨床普遍認(rèn)為長程維持治療聯(lián)合高劑量誘導(dǎo)的療效優(yōu)于單個或多個療程的低劑量治療，《指南》中也指出本品誘導(dǎo)治療應(yīng)持續(xù)2～3周，總療程3-4周。值得注意的是，更昔洛韋口服生物利用度低且為強堿性，刺激大，需靜脈給藥，且反應(yīng)發(fā)生率較高，部分患兒不能加持完成療程，導(dǎo)致病情反復(fù)，臨床應(yīng)用需謹(jǐn)慎。