冷應激對雛鵪鶉胸腺組織超微結構的影響

劉春朋，付 晶*

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣州 510225；2.廣東省水禽健康養殖重點實驗室，廣州 510225）

在畜牧業養殖生產過程中，除了營養、遺傳因素之外，環境也是一個重要的因素。動物在飼養過程中，經常遭受各種環境應激源的影響，如溫度應激（冷、熱）、光照應激、有害氣體應激（硫化氫、氨氣）、粉塵應激以及運輸應激等，其中溫度應激比較普遍[1]。如果這些應激得不到及時治理，將會直接影響到畜禽的健康以及畜產品品質，進而危害人類健康。寒冷是北方地區畜牧生產所面臨的普遍應激源。冷應激可引起畜禽尤其是幼畜或新生仔畜的神經內分泌系統紊亂、免疫機能下降、腹瀉、生產性能下降甚至死亡[2]。鵪鶉是一種高產高效的特禽，其生物學特性比較特殊，鵪鶉在飼養過程中對環境溫度的要求是相對較高的，尤其是育雛期的溫度比雞還要高，因此更容易受到冷應激的影響[3]。

胸腺是禽類免疫系統中重要的淋巴器官，其參與細胞免疫的過程，是T細胞分化、發育、產生的場所，在整個免疫系統中起著中樞作用，其損傷必將導致免疫功能障礙進而引發一系列疾病。有研究表明，當雞受到熱應激后，免疫器官有明顯損傷，尤其是胸腺組織會發生萎縮性變化，機體免疫功能下降[4]。而目前關于冷應激對雛鵪鶉胸腺組織形態結構的影響研究較少。因此，本試驗以1日齡雛鵪鶉為研究對象，通過對雛鵪鶉胸腺組織病理組織學觀察，探討冷應激導致禽類免疫功能下降的作用機制，以期為更好地研究鵪鶉內環境打下基礎，也為探索促進禽類冷適應的方法、提高禽類的抗寒能力提供理論依據。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

1日齡健康沙維瑪特肉用公鵪鶉360只，購自哈爾濱萬家特禽養殖合作社。

1.2 主要試劑

磷酸戊二醛、乙醇、丙酮、四氧化鋨等常規試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 主要儀器

Phenix/鳳凰電子顯微鏡（型號為PH100-DB500 U-IPL），購自鳳凰光學集團有限公司；日立高新透射電鏡（型號為HT7700），購自天美（中國）科學儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 冷應激模型的建立

2.1.1 急性冷應激

試驗將1日齡沙威瑪特肉用鵪鶉180只飼養至15日齡，隨機分為6組，每組30只。對照組冷應激0 h（即放在鵪鶉正常育雛期所需溫度34±1℃的舍內飼養），其余5組分別進行冷應激處理，即把鵪鶉置于（12±1）℃的舍內飼養，飼養時間分別為0.5、1、3、6和12 h。在各時間隨機選取10只進行剖殺，并采集胸腺組織。

2.1.2 慢性冷應激

試驗將1日齡沙威瑪特肉用鵪鶉180只飼養至15日齡，隨機分為6組，每組30只。前3組為對照組，即正常溫度下分別飼養5、10和20 d后剖殺；其余3組為應激組，分別于（12±1）℃冷應激環境下飼養5、10和20 d后剖殺取樣。

整個試驗過程中，各組雛鵪鶉均自由飲水和采食，并按常規免疫程序進行免疫。

2.2 胸腺組織超微結構的觀察

鵪鶉剖殺時迅速在每只鵪鶉中采集3份1 mm3大小的胸腺組織樣品，并固定于濃度為2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液（pH為7.2）中＞4 h。然后根據廖望的試驗方法，將固定好的樣品用PBS漂洗3次，15 min·次-1；之后使用2%鋨酸固定2 h，再用PBS漂洗3次，再依次進行脫水、置換、浸透、包埋、聚合、切片、染色等過程[5]。最后在透射電鏡下進行超微結構的觀察。

3 結果與分析

3.1 急性冷應激時胸腺組織超微結構的變化

急性冷應激時胸腺組織的超微結構變化見圖1。

圖1 急性冷應激時胸腺組織的超微結構變化

急性冷應激時，對照組細胞結構規則，排列緊密，細胞核成卵圓形，清晰可見，線粒體嵴排列整齊，內外膜結構清晰，無腫脹肥大現象，內質網及高爾基體形態規則，無擴張（見圖1A）；急性冷應激0.5 h時，線粒體出現輕微的嵴斷裂，核仁大多瓦解消失（見圖1B）；急性冷應激1h時，線粒體出現較嚴重的空泡化，細胞間隙增寬（見圖1C）；急性冷應激3 h時，細胞核輕微變形，細胞數量減少，細胞間隙增大（見圖1D）；急性冷應激6 h時，個別細胞出現凋亡現象（見圖1E）；急性冷應激12 h時，細胞核破裂，變大或者消失，發生細胞凋亡（見圖1F）。

3.2 慢性冷應激時法氏囊組織超微結構的變化

慢性冷應激時胸腺組織的超微結構變化見圖2。慢性冷應激時，5 d的對照組胸腺組織超微結構顯示為：細胞結構規則，排列緊密，細胞核成卵圓形，清晰可見，線粒體嵴排列整齊，內外膜結構清晰（見圖2A）；冷應激5 d時，嵴數量減少，內質網擴增，部分內質網有包被受損線粒體的趨勢（見圖2B）；冷應激10 d時，細胞排列松散，細胞核輕微變形染色質結塊，部分邊聚，并出現內質網包被線粒體（見圖2C，2D）；冷應激20 d時，線粒體空泡，內質網增多，染色質結塊，出現細胞凋亡和自噬溶酶體（見圖2E，2F）。

圖2 慢性冷應激時胸腺組織的超微結構變化

4 討論

胸腺參與機體的細胞免疫，胸腺的發育狀態和機能的強弱將直接影響著自身免疫水平。應激可以導致畜禽機體免疫機能下降、生產性能下降、誘發疾病甚至死亡[6]。研究結果表明，冷應激引起的機體免疫力下降涉及體液免疫、細胞免疫以及腸道黏膜免疫[7-9]。由于研究者所使用的實驗動物存在種屬差異且應激的強度及持續時間也不相同。因此，目前關于冷應激對畜禽免疫損傷的機制并不十分清楚。細胞凋亡是由多基因控制的細胞主動死亡的過程，是程序性細胞壞死的主要形式[10]。關于熱應激能夠導致畜禽免疫器官發生形態學損傷和細胞凋亡的研究已有報道。唐嘉等研究表明，在熱應激下對雞的胸腺體積、胸腺小葉、皮髓質等進行觀察得出胸腺與對照組相比體積、胸腺小葉的數量、胸腺小體的個數、皮髓質的比例均減小，出現胸腺萎縮，而這種萎縮與細胞凋亡有關[11]。此外，熱應激下雞胸腺組織遭受到較大損害，出現嚴重的空泡化現象，濾泡間隙增大，結締組織出現增生[12]。

試驗通過對雛鵪鶉胸腺組織超微結構的觀察，發現冷應激能夠導致胸腺組織細胞器受損，發生細胞凋亡，且隨應激時間的延長凋亡細胞數量增多，慢性冷應激的凋亡程度重于急性冷應激，這與前人的研究結果基本一致。這可能是冷應激造成機體免疫損傷的一個途徑。在以后的研究中，可以從細胞凋亡通路進一步探討冷應激致雛鵪鶉免疫器官損傷的機制。