黃瓜CsGA20ox1異源表達促進擬南芥植株發育

龐保亞,李 強,任仲海

山東農業大學園藝科學與工程學院,山東果蔬優質高效生產協同創新中心,農業部黃淮地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,作物生物學國家重點實驗室,山東 泰安 271018

黃瓜（Cucumis sativusL.）一年生的草本植物，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae），是世界十大蔬菜之一，我國是世界上黃瓜生產面積最大、總產量最高的國家[1-3]。赤霉素是植物體內重要的激素調節物質之一。研究表明赤霉素在植物生長發育過程中起重要作用，包括種子萌發、表皮毛發育、莖和葉的伸長、花的發育和果實的形成[4-10]。另外赤霉素在植物免疫方面也有重要作用[11]。目前，赤霉素合成途徑在一些植物中已經研究的比較清楚，在高等植物中赤霉素的生物合成是一個多級化的氧化酶催化反應過程并且是保守的[12]，赤霉素氧化酶GA20ox1是催化反應的關鍵酶之一。

在已知的赤霉素生物合成路徑中有三種關鍵酶類，分別是GA20ox,GA3ox和GA2ox。這三種酶類屬于20G-Fe(II)oxygenase亞家族并且是被多基因家族所編碼[9]。其中赤霉素20-氧化酶是目前已知的在赤霉素合成過程中重要的限速酶，在赤霉素合成后期催化連續的氧化反應[13]，它以中間產物（GA12,GA53,GA15,GA44,GA24,GA19）為底物最終形成GA9和GA20，再經過赤霉素3-氧化酶的作用最終形成有生物活性的赤霉素[14]。在擬南芥中，含有5個赤霉素20-氧化酶，進化樹分析表明AtGA20ox1，2，3和4的親緣關系非常近，而AtGA20ox5與其余四種親緣關系較遠；分析比較催化活性發現AtGA20ox1，2，3和4均具有完整的催化能力，而AtGA20ox5只能催化前兩步反應，不具有完整的催化活性；功能分析表明AtGA20ox3與AtGA20ox1和AtGA20ox2具有功能冗余性，ga20ox1突變體表現出植株矮小的性狀，而ga20ox2單突變體和ga20ox3單突變體并沒有明顯變化。ga20ox1-3三突變體植株表現出嚴重的植株矮小和不育，以ga20ox1-3三突變體為背景突變AtGA20ox4或AtGA20ox5沒有進一步影響植株表型[15,16]，而超量表達AtGA20ox1由于提高了赤霉素的水平而增強植株的生長[17-20]，表現出蓮座叢增大和葉柄長度增加[13]。最近的研究發現，在水稻中GNP1即AtGA20ox1的同源基因OsGA20ox1可以催化合成赤霉素合成必須的重要中間產物GA20，促進赤霉素的合成，同時超量表達OsGA20ox1可以增加谷粒的數量和最終的產量[21]。棉花中GhGA20ox1在煙草中異源表達不僅增加了葉柄的長度，并且顯著增加了子葉下胚軸、果炳和花的長度[22]。研究表明在黃瓜中同樣含有5個赤霉素20氧化酶（CsGA20ox1，2，3，4和5），并且5個氧化酶的功能是相似的，都可以將GA12轉化為GA9（主要產物）和GA25（次要產物），另外，CsGA20ox1還可以有效催化13-羥基化途徑中早期的GA53轉化為GA20的反應[23]。但CsGA20ox1在黃瓜生長發育過程中的作用還不清楚。

為探明CsGA20ox1在黃瓜生長發育中的作用，本實驗采用同源克隆的方法克隆了黃瓜赤霉素20-氧化酶基因CsGA20ox1，成功構建了CsGA20ox1超量表達載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化獲得了CsGA20ox1轉基因擬南芥株系。通過分析轉基因擬南芥種子萌發速率、轉基因擬南芥地上部分生長情況和葉片表皮細胞大小，初步揭示CsGA20ox1在植株生長發育中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“新泰密刺”黃瓜取自山東農業大學南校區園藝試驗站，取樣時間為2017年5月至7月。分別對不同的組織生長根、幼莖、新生葉、開花當天的花、開花當天的果實和卷須取樣，樣品用液氮速凍保存用于檢測CsGA20ox1表達。

選擇3周左右生長狀態一致的擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh）轉基因植株拍照并測量葉片面積、葉柄長度和蓮座叢面積。取新生葉片，樣品用液氮速凍保存用于檢測CsGA20ox1、AtGA20ox1等基因的表達。

1.2 總 RNA的提取以及實時熒光定量PCR分析

轉基因擬南芥和黃瓜各組織的RNA提取均采用TRIZOL法，以提取的總RNA為模板，按照北京全式金生物技術有限公司cDNASynthesis Super Mix試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

選取CsActin（GenBank accession number AB010922）為黃瓜內參基因和AtGAPDH為擬南芥內參基因。PCR 反應體系為：1 μL cDNA，2.5 μL 10×Taq buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上、下游引物各 1 μL（10 μmol·L-1）和 0.5 μL（5 U·μL-1）Taq 酶（全式金，北京），加去離子水至 25 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，72℃5 min，28～32個循環；PCR產物1%瓊脂糖凝膠電泳。熒光定量PCR使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR反應都設 3 次重復。PCR 反應體系為：2×Realtime PCR Super mix 10 μL，上、下游引物濃度為 0.5 μmol·L-1，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s 40個循環。采用2-ΔΔCT法進行定量數據分析。

1.3 亞細胞定位

通過引物中引入的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點，將CsGA20ox1基因從pJET-T載體切下回收，并對pROKⅡ進行相同酶切位點的酶切，將兩者在22℃連接，轉化大腸桿菌，鑒定陽性單菌落。構建pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP表達載體。

通過液氮凍融法將質粒pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP和p19轉入農桿菌C58C1。以農桿菌浸潤法侵染本生煙,挑取陽性菌落接種到含對應抗生素的LB液體培養基(25 mg·L-1Rif,50 mg·L-1Kan)，每分鐘200 轉 28 ℃振蕩培養 12～16 h。將 2 種菌液 5000×g 離心 5 min，懸浮(懸浮緩沖液:10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1As)。含 p19 的菌液與含 pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP 菌液等體積混合，使其OD600為0.6～0.8。室溫靜置3 h后注射煙草葉片，48～96 h內觀察定位結果。

熒光觀察時撕取浸潤48～96 h的本生煙葉片下表皮進行觀察。GFP經488 nm激光激發，通過550～590 nm濾鏡后獲得熒光信號。

1.4 植物過表達載體的構建及擬南芥轉基因株系的獲得

通過引物中引入的BamHⅠ和SacⅠ酶切位點，將CsGA20ox1基因從pJET-T載體切出回收，并對pBI121進行相同酶切位點的酶切，將兩者在22℃連接，轉化大腸桿菌，鑒定陽性單菌落。構建pBI121-CsGA20ox1植物過表達載體。

轉基因擬南芥通過侵染擬南芥花序的方法獲得[24]。經過50 mg·L-1卡那抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉基因植株，收取種子，經過自交純化得到純合株系，進行表型分析。

1.5 擬南芥葉面積、葉柄長度和蓮座叢面積的測量

野生型（WT）擬南芥和轉基因（CsGA20ox1）擬南芥在恒溫光照條件下培養23 d，對蓮座叢和第六片葉進行拍照，并運用Image J測量葉面積、葉柄長度和蓮座叢面積。

1.6 DIC(Differential Interference Contrast)實驗

脫色：取上面拍照所用的第六片真葉，用14%冰醋酸和84%的乙醇混合液(比例1:4)，浸泡24 h。

脫水：用75%乙醇浸泡24 h，重復1次；再用99.5%乙醇浸泡脫水24 h，重復1次；最后用水合三氯乙醛浸泡30 min。

觀察：制作臨時玻片，通過顯微鏡觀察葉片下表皮細胞并拍照。

3次生物學重復，每次每個株系取三片以上真葉進行處理觀察，觀察時選取葉片中間遠離葉脈及表皮毛的部位，運用五點取樣法測量表皮細胞面積。

2 結果與分析

2.1 黃瓜CsGA20ox1的分離克隆及系統進化樹分析

圖1 黃瓜CsGA20ox1及其他物種同源基因的進化分析Fig.2 Evolution analysis of cucumber CsGA20ox1 and other homologous genes

以黃瓜cDNA為模板，CsGA20ox1-OE-F/R為引物進行PCR擴增，獲得1122 bp特異條帶。該基因編碼一個含374個氨基酸的蛋白質。利用MEGA7.0軟件將黃瓜CsGA20ox1蛋白序列與擬南芥、水稻的GA20ox蛋白序列進行同源序列比對分析并構建進化樹（圖1），結果表明，黃瓜CsGA20ox1與擬南芥AtGA20ox1、2、3和4的氨基酸序列同源性較高且親緣關系比較近。

2.2 黃瓜中CsGA20ox1表達模式分析

為了探明CsGA20ox1在黃瓜不同組織中的表達特性，在同一時間獲取黃瓜各個組織，提取總RNA（三個生物學重復）后反轉錄得到cDNA第一鏈，以此作為模板進行定量PCR分析。結果如圖2所示，CsGA20ox1在黃瓜子房和幼葉中表達量較高，在花和卷須中表達量相對較低。

圖2 CsGA20ox1在黃瓜不同組織中的表達分析Fig.2Analysis of the expression of CsGA20ox1 gene in different tissues of cucumber

2.3 CsGA20ox1的亞細胞定位

為探究CsGA20ox1的亞細胞定位，構建了以35S為強啟動子驅動的含有CsGA20ox1完整編碼區并連接GFP的融合蛋白表達載體（35S::CsGA20ox1-GFP），以35S::GFP為對照，通過農桿菌侵染煙草葉片進行瞬時表達。經過三次生物學重復，每次觀察三個以上臨時玻片得到結果如圖3（D-F）所示，融合蛋白在煙草葉片表皮細胞的細胞核中有熒光信號，表明CsGA20ox1在細胞核中有表達。

圖3 CsGA20ox1的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of CsGA20ox1

2.4 擬南芥中異源表達CsGA20ox1

構建CsGA20ox1超量表達載體pBI121-CsGA20ox1（圖4），轉化農桿菌LBA4404，利用侵染擬南芥花序的方法進行基因的遺傳轉化。通過自交純化得到OE-7、OE-9和OE-10純合轉基因株系，實時熒光定量PCR檢測轉基因株系CsGA20ox1表達量如圖5。

圖4 pBI-121-CsGA20ox1結構示意圖Fig.4 pBI-121-CsGA20ox1 structure diagram

2.5 超量表達CsGA20ox1提高擬南芥種子萌發速率

對獲得的CsGA20ox1擬南芥轉基因株系進行種子萌發實驗。每次播種100粒種子統計發芽率，三次生物學重復得到結果如圖6所示，在培養12 h后轉基因擬南芥開始萌發，在24 h、36 h、48 h和60 h轉基因擬南芥的種子萌發率顯著高于野生型擬南芥，72 h后種子發芽率均達到99%以上，說明選取的種子良好，表明超量表達CsGA20ox1提高了擬南芥種子的萌發速率。

圖5 CsGA20ox1在野生型（WT）和轉基因擬南芥OE-7、OE-9、OE-10株系中的表達水平Fig.5 Expression value of CsGA20ox1 in wild type(WT)and transgenic Arabidopsis thaliana OE-7,OE-9andOE-10strain

圖6 野生型擬南芥（WT）和轉基因株系（OE-7、OE-9、OE10）的種子萌發率統計Fig.6 Seed germination rate of wild type Arabidopsis(WT)and transgenic strain(OE-7,OE-9 and OE-10)

2.6 超量表達CsGA20ox1可以增加擬南芥地上部分的葉面積、葉柄長度和蓮座葉大小

對獲得的CsGA20ox1轉基因擬南芥生長狀況進行觀察，在培養23 d后發現，轉基因擬南芥蓮座葉面積明顯大于野生型（圖7-A）。通過比較此時期各個葉片的大小發現第六片真葉差異最明顯。因此，選擇第六片真葉來統計葉面積和葉柄長度。統計結果表明與野生型相比轉基因擬南芥三個株系的葉面積、葉柄長度均有所增加，其中OE-7增加54%、OE-9增加150%、OE-10增加179%。說明CsGA20ox1基因在擬南芥中異源表達可以促進植株地上部分的生長發育。

圖7 野生型和轉基因擬南芥蓮座叢面積及第六片真葉葉面積和葉柄長度表型及統計Fig.7 Phenotype and statistics of rosette area,the sixth euphylla area and petiole length of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana

2.7 超量表達CsGA20ox1增大葉片表皮細胞面積

異源表達CsGA20ox1后擬南芥表現出葉面積增大的表型，說明CsGA20ox1可能影響了葉片細胞的大小或者數量。取WT和轉基因株系植株同一部位葉片，通過DIC實驗觀察葉片表皮細胞(選取葉片中部并避免葉脈存在)結果如圖8，可以看出與野生型相比，轉基因株系的葉片表皮細胞有顯著增大。統計結果表明與野生型相比，表皮細胞面積OE-7增加21%、OE-9增加46%、OE-10增加58%。

圖8 觀察統計野生型和轉基因擬南芥葉片下表皮細胞大小Fig.8 Observation and statistics on the size of epidermal cells in leaves of wild-type and transgenicArabidopsis thaliana

3 討 論

進化樹分析表明，黃瓜CsGA20ox1與擬南芥AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4親緣關系均非常近，推測其功能相近。同時，組織表達分析結果顯示，該基因在黃瓜各組織中均有表達，其中在幼葉和開花當天的果實中表達量較高，CsGA20ox1可能在種子萌發和葉片生長發育過程中起著重要的調節作用。

目前，在黃瓜中赤霉素氧化酶的亞細胞定位還沒有相關研究，但是在擬南芥、水稻等植物中已有所研究。在擬南芥赤霉素氧化酶AtGA20ox2的亞細胞定位是通過構建融合熒光蛋白表達載體并在煙草葉片中瞬時表達實現的，檢測熒光信號顯示擬南芥AtGA20ox2同時在細胞核和細胞質中表達[25]。另外，赤霉素氧化酶的GA2ox家族基因的亞細胞定位也有所研究，在水稻中通過侵染洋蔥表皮細胞研究赤霉素氧化酶OsGA2ox5、OsGA2ox6的亞細胞定位，結果顯示其均是在細胞核和細胞質中表達[26-27]，而本實驗結果（如圖4）CsGA20ox1主要在細胞核中表達。

為了進一步研究CsGA20ox1在黃瓜生長發育中的功能，我們構建了CsGA20ox1基因的超量表達載體，并通過農桿菌介導遺傳轉化擬南芥。轉基因擬南芥表現出種子萌發速率加快（圖7）并且地上部分生長狀況明顯優于野生型（圖8），表明CsGA20ox1在促進種子萌發速率和植株生長中發揮重要作用。以前的研究表明通過外源施加赤霉素可以顯著促進茄子、西瓜的種子萌發[28,29]，在白菜生長過程中通過外源施加赤霉素可以顯著促進白菜整個植株的生長發育[30]。這說明轉基因擬南芥（CsGA20ox1）促進種子萌發和植株發育可能是由于促進了擬南芥體內赤霉素的合成所引起的。另外轉基因擬南芥葉面積的增大可能是由于增加了單個細胞的面積，通過顯微鏡觀察統計，結果也證實了轉基因擬南芥葉片表皮細胞的平均面積與野生型相比有顯著增加（圖8），但是葉片細胞數量有沒有增加還不清楚需要通過進一步實驗探究。

4 結 論

通過克隆獲得黃瓜CsGA20ox1，該基因編碼373個氨基酸。進化樹分析表明該基因與擬南芥AtGA20ox1親緣關系最近，組織表達特異性分析結果顯示黃瓜CsGA20ox1主要在幼葉和開花當天的果實中表達。亞細胞定位結果表明黃瓜CsGA20ox1主要在細胞核中表達。在擬南芥中異源表達黃瓜基因CsGA20ox1能夠促進種子萌發和植株生長，其中葉片的增大可能是通過增大細胞面積和增加細胞數量實現的。因此，黃瓜CsGA20ox1可以促進種子萌發和葉片生長發育。