肝纖維化模型小鼠肝組織環狀RNA表達譜分析

周玉平，呂雪幼，璩輝，朱林文，葉國良，郭俊明

（1.寧波大學醫學院附屬醫院 消化內科，浙江 寧波 315020；2.寧波大學醫學院 生物化學與分子生物學研究所 浙江省病理生理學技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315211）

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是近年來非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）領域最新的研究熱點。circRNA是一類通過特殊剪切產生的ncRNA分子，大量存在于真核細胞，具有一定的組織、時序、疾病特異性，在疾病的發生發展中發揮著重要的調控作用[1]。circRNA對肝纖維化的發生發展是否具有調控作用目前尚不明確。因此，本研究采用circRNA芯片技術分析肝纖維化模型肝組織的circRNA表達譜，并用生物信息學方法分析差異表達circRNA的可能生物學功能，以期從circRNA角度解析肝纖維化的發病機制，為肝纖維化研究提供新的方向和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠，體質量為（20±2）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養及實驗在寧波大學醫學院實驗動物中心進行，并獲得寧波大學動物倫理委員會批準同意。

1.1.2 主要試劑和儀器：四氯化碳（CCl4）分析純（上海國藥集團），橄欖油化學純（上海國藥集團），蘇木精（美國Sigma公司），麗春紅（美國Sigma公司），苯胺藍（美國Sigma公司），Trizol（美國Invitrogen公司），核酸外切酶RNase R（美國Epicentre公司），ds-cDNA合成試劑盒（美國Invitrogen公司），ds-cDNA標記試劑盒（瑞士NimbleGen公司），2×PCR master mix（美國Arraystar公司），Gene Amp PCR System 9700（美國Applied Biosystems公司），ViiA 7 Real-time PCR System（美國Applied Bio

systems公司），Mouse circular RNA Array V2.0芯片（美國Arraystar公司），分子雜交儀（美國Agilent公司），Scanner G2505C芯片掃描儀（美國Agilent公司）。小鼠PCR引物由上海英駿生物技術有限公司合成，序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 動物造模和肝組織采集：實驗小鼠隨機分為正常對照組、模型組，每組各8只。模型組按體質量以15% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg，腹腔注射，每周3次，正常對照組不處理，5周末采集小鼠肝臟組織。先用3%戊巴比妥鈉以5 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠，打開腹腔，觀察肝脾大體形態，經下腔靜脈采血，迅速切取肝臟最大葉，放入4%多聚甲醛中固定用于石蠟切片組織學觀察；其余肝葉投入液氮中速凍，轉入-80 ℃長期保存備用。

表1 PCR所用引物序列

1.2.2 組織病理學觀察：常規制備肝組織石蠟切片行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥和膠原增生情況。Masson染色后光學顯微鏡下可見膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色，細胞核成藍褐色。組織切片由2位病理專家盲法進行閱片。

1.2.3 ds-cDNA合成、標記與雜交：cicrRNA芯片分析由上海康成生物有限公司完成。正常對照組和模型組小鼠隨機取3例，分別提取肝組織總RNA，先用RNase R消化總RNA，去除線性RNA，富集circRNA，將富集的circRNA采用隨機引物轉錄，擴增為熒光標記的cRNA探針，cRNA探針與Arraystar Mouse circRNA Arrays V2（8x15K）芯片進行雜交。

1.2.4 cicrRNA芯片數據分析：采用Agilent Scanner G2505C掃描芯片，Agilent Feature Extraction software（version 11.0.1.1）軟件分析結果。2組樣本間差異表達的circRNA通過變化倍數和P值進行篩選，將變化倍數＞2倍，P＜0.05視為差異表達。將篩選出的差異circRNA繪制散點圖，并對所得數據進行監督性層次聚類分析。每條circRNA均用美國Arraystar公司的微小RNA（microRNA，miRNA）結合位點預測軟件mirTarget預測5個高匹配值的miRNA結合位點。

1.2.5 RT-qPCR：Trizol法提取肝組織樣本總RNA，并測定RNA的純度和濃度，經反轉錄反應合成cDNA模板，將master mix預混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反應溶液，進行PCR擴增反應，設置參數如下：95 ℃ 10 min預變性；40個PCR循環（95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s）。以GAPDH為管家基因，標準曲線法計算目的基因的相對表達量。每個樣本重復3次實驗。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行分析。數據以±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠肝組織病理學觀察 HE染色顯示，正常對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周放射排列，中央靜脈、匯管區動靜脈和膽管結構正常；模型組肝細胞廣泛壞死，正常肝小葉結構消失，可見大量的炎性細胞浸潤。Masson染色顯示：正常對照組小鼠僅在匯管區和中央靜脈見少量膠原纖維；模型組肝組織膠原廣泛增生，由匯管區向四周放射延伸，部分形成大小不一的完整假小葉結構。見圖1。

圖1 2組小鼠肝組織HE染色（×200）和Masson染色（×100）結果

2.2 cicrRNA芯片篩查結果 cicrRNA芯片篩查結果顯示，共檢測到10 389個cicrRNA，與正常對照組相比，模型組肝組織差異表達的circRNA共有69個，其中上調2倍以上的有14個，下調2倍以上的有55個；上調4倍以上的有1個，下調4倍以上的有5個，結果見表2和圖2A。監督性分層聚類分析顯示，差異表達的circRNA能正確區分模型組和正常對照組，見圖2B。

2.3 差異cicrRNA的RT-qPCR驗證 綜合芯片結果的差異倍數高、組內樣本一致性好、circRNA類型等因素，選取其中差異倍數4倍以上，屬于外顯子（exonic）類型的5個circRNA作為目標circRNA，進行RT-qPCR驗證，結果顯示，5個circRNA變化趨勢與芯片結果一致，其中4個差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

表2 差異表達4倍以上的circRNA

圖2 利用散點圖和熱圖分析circRNA表達譜變化

2.4 cicrRNA作用的靶miRNA的預測 運用mirTarget軟件對上述5個cicrRNA進行分析，得到可能與之相互作用的miRNA（見表3）。對這些miRNA進行文獻檢索分析發現，miRNA-338-3p[1]、miRNA-141[2-3]與肝纖維化發生機制有關。

表3 生物信息學分析預測的可能與circRNA相互作用的miRNA

圖3 部分差異circRNA的肝組織RT-qPCR驗證

3 討論

circRNA相關研究進展迅速，已有的研究證實circRNA的生物學功能至少包括以下幾個方面：miRNA海綿作用、調控基因轉錄、調控RNA結合蛋白等[4]。其中，miRNA海綿作用最受關注，研究表明，外顯子來源的circRNA表面存在miRNA的反應元件（microRNA response element，MRE），能特異性結合miRNA，調控下游基因的表達[5]。目前對于circRNA與疾病的研究主要集中在腫瘤領域。circRNA與肝臟疾病的研究目前報道不多，已有的研究主要是關于原發性肝癌circRNA診斷標志物的發現[6]。此外，還有研究發現，circRNA與非酒精性脂肪肝及肝再生機制有關[7-8]。circRNA與肝纖維化的相關研究則鮮有報道。最近，CHEN等[9]報道circRNA與肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）活化有關，初步探討了circRNA與肝纖維化的關系。

本研究采用高通量芯片初步研究了經典的CCl4肝纖維化小鼠模型肝組織的circRNA的表達譜變化，結果顯示，部分circRNA在模型組肝組織中表達明顯變化，提示circRNA可能與肝纖維化進展有關。根據芯片結果的差異倍數高、組內樣本一致性好，我們選取部分差異circRNA進一步進行了RT-qPCR驗證和生物信息學功能預測，結果發現，mmu_circ_42398、mmu_circ_42397、mmu_circ_34116的靶miRNA（包括miR-338-3p、miR-22-3p、miR-141-5p）與肝纖維化發病機制密切相關[1-3，10]，本研究結果提示，circRNA與肝纖維化發生和發展過程存在一定關聯，circRNA可能通過miRNA分子海綿作用，參與肝纖維化的進展，但還需要進一步驗證。